LC-MS分析用超純水
高速液体クロマトグラフィー-質量分析法（HPLC-MS、一般的にはLC-MSと呼ばれる）は、液体クロマトグラフィーの物理的分離能力と質量分析法の質量分析能力を組み合わせた、強力かつ汎用性の高い分析手法である。多くの用途に用いられるLC-MSでは、正確な分析を行うために、不純物を含まない水が必要となる。
LC-MSの応用例
LC-MSは極めて高い感度と特異性を備えており、複雑な混合物中の化合物の同定、定量、および特性解析に用いられます。
化学物質や医薬品の混合物、環境試料、食品試料、生物試料など、多種多様な試料がLC-MS分析に適しています。LC-MSの汎用性の高さから、単一細胞の分析から医薬品開発、食品安全性に至るまで、あらゆる分野において不可欠な技術となっています。しかし、その高感度さゆえに、微量の不純物でも結果に偏りが生じる可能性があるため、これらの用途では超純水の使用が求められます。
また、LC-MSはオミクス（プロテオミクス、メタボロミクス、リピドミクス）、プレシジョン・メディシン、環境エクスポソミクスといった多くの最先端研究分野においても中心的な役割を果たしており、複雑な生物学的・化学的システムに対する深い洞察を可能にしています。LC-MSの進歩には、ハイスループット用途への応用や、さらなる小型化などが挙げられます。
LC-MSの原理
LC-MSでは、試料中に存在する化合物は、まずその化学的性質に基づいて液体クロマトグラフィーによりカラム上で分離されます（記事「HPLCおよびUHPLC分析用の水」を参照）。 その後、分離された化合物は質量分析計に導入され（図1参照）、そこでイオン化され、質量電荷比（m/z）に基づいて分析されることで、同定および定量が可能となる。また、LC-MSは、感度と特異性を高めるために、LC-MS/MS（タンデム質量分析）として構成することもできる。
図1.LC-MS装置の概略図
質量分析におけるイオン化法
LC-MS装置の質量分析計（MS）部分では、プロセスはイオン源から始まり、そこで液体クロマトグラフィーによって分離された化合物がイオン化されます。一般的なイオン化法には、エレクトロスプレーイオン化（ESI）や大気圧化学イオン化（APCI）などがあり、これらは液体試料から荷電イオンを生成します：
- エレクトロスプレーイオン化（ESI） - 分析対象溶液に高電圧（通常2.5～4 kV）を印加したキャピラリー（エレクトロスプレー針）を通過させることで、大気圧下でイオンが生成されます。これにより、溶媒と分析対象分子を含む荷電エアロゾル液滴が形成され、最終的に溶媒を失った後、質量分析器へと導かれます。
- 大気圧化学イオン化（APCI） - イオンは、大気圧下でのイオン／分子反応によって生成されます。分析対象物質の溶液は、キャピラリーを介してネブライザーに導入され、加熱された石英管内で脱溶媒化された後、コロナ放電からの電子によってイオン化されます。このプロセスにより、分析対象物質の効率的なイオン化が実現されます。
質量分析用の質量分析器オプション
生成されたイオンは質量分析器へと導かれ、そこで四重極、飛行時間型（TOF）、またはイオントラップなどの様々な手法を用いて、質量電荷比（m/z）に基づいて分離されます。
- 四重極型：この分析器は4本のロッドを用いて振動電場を生成し、質量電荷比（m/z）に基づいてイオンを選別します。四重極型質量分析計は、その安定性と速度の高さから、ターゲット分析および定量分析の両方で広く使用されています。
- 飛行時間型（TOF）：TOF分析器では、イオンは飛行管内に加速され、そこで一定の距離を移動します。検出器に到達するまでの時間はm/zと相関しており、これにより広い質量範囲にわたる高分解能分析が可能になります。
- イオントラップ：この分析装置は、3次元電場内でイオンを捕捉し、m/zに基づいて順次放出します。イオントラップは汎用性が高く、詳細な構造解析のために、多段階質量分析（MS/MSから多段階MS（MSn）まで）を行うことができます。
最後に、検出器が各イオンの存在量を測定し、試料中の化合物を同定・定量するための情報を提供する質量スペクトルを生成する。
LC-MSにおける水質の影響
LC-MSのワークフロー全体を通じて水が使用されます。水は通常、移動相の調製、標準液の希釈、およびブランクとして使用されます。また、試料の調製にも頻繁に使用されます。分析の精度を確保し、装置を保護するため、流路に入る水は高純度である必要があります。
LC-MSは非常に高感度の分析手法であるため、汚染物質に対して極めて敏感です。1 水中の汚染物質の多くは、LC-MS装置のHPLC部分に悪影響を及ぼす可能性がありますが、中にはMS検出に特異的に影響を与えるものもあります。
LC-MSに使用される水の汚染は、さまざまな形で分析結果や機器に影響を及ぼす可能性があります：
有機物
溶出液の調製に使用される水に含まれる有機分子は、バックグラウンドノイズの原因となる可能性があります。また、イオンの抑制や増強を引き起こし、質量分析検出に干渉する恐れもあります。これにより、同定や定量が困難になる場合があります。
また、カラムビーズの表面に蓄積し、試料や溶媒分子が結合部位に到達する速度を遅らせる可能性があります。これにより物質移動の問題が生じ、分解能と感度の低下を招き、最終的にはカラムの寿命を縮めることになります。
有機物はカラムのヘッド部に蓄積し、後に外来ピークやゴーストピークとして溶出することで、干渉を引き起こし、定量を困難にする可能性があります。
有機物の汚染レベルが非常に高い場合、汚染物質によって保持時間のシフトやピーク形状の歪みが生じる可能性があります。これにより、分解能の低下、同定および定量の困難化につながる恐れがあります。
これらの理由から、LC-MS分析に使用する水中の有機物の濃度を正確に監視することが極めて重要であり、これはオンラインTOCモニターを用いて容易に行うことができます。
イオン
水中の金属イオン（Na+、K+ など）による汚染は、対象分子との付加体の形成につながり、自動ピーク検出やライブラリ照合を複雑にし、データの解釈を困難にする可能性があります。 塩化物や臭化物などのハロゲンは、分析対象物質と付加体や錯体を形成することで、正のエレクトロスプレーイオン化（ESI+）モードではイオン抑制を引き起こし、負のエレクトロスプレーイオン化（ESI-）モードではバックグラウンドノイズを増加させる可能性があります。
水中のイオンの存在は、LC-MS 分析の全体的な性能に影響を与え、分析物の検出限界や定量に影響を及ぼす可能性があります。
粒子
粒子は、HPLC のポンプやインジェクターを損傷するおそれがあります。また、カラムやフリットに堆積し、背圧の上昇を引き起こす可能性もあります。
細菌
細菌は、カラムやフリットに蓄積する可能性があります。また、有機性の副生成物を放出することもあります。
事例研究：有機汚染がLC-MSの感度に及ぼす影響
信頼性の高いLC-MSデータを得るためには、検出された分析対象物質が、分析ワークフローで使用される水ではなく、確実に試料に由来するものであることを確認することが重要です。
本研究では、以下の2種類の水を評価しました：
- 当社顧客の研究室の水道水。
- その実験室に設置されたMilli-Q®浄水システムから新たに分注された超純水。 このMilli-Q®システムには、Milli-Q® IX純水システムと同様に、インテリジェント逆浸透、Elix®電気脱イオン、および殺菌用UVランプを用いた前処理が組み込まれていました。前処理の後、Milli-Q® IQ 7000システムと同様のMilli-Q®精製システムを使用して、超純水を供給しました。
同研究所の水道水には、対象分析物質であるエストラジオールが微量に含まれていることが判明し、試験サンプル中のエストラジオール分析には不適であることが判明した。これに対し、Milli-Q®水処理システムによる浄化後、得られた超純水からはエストラジオールは検出されず、したがってこれらの高感度分析に適していた（図2）。
これらの結果は、水道水に微量の分析対象物質による汚染が含まれている場合でも、Milli-Q®超純水システムによる浄化により、最も要求の厳しい分析用途にも十分な品質の水が確実に得られることを示しています。総酸化性炭素（TOC）の濃度は、有機汚染の一般的な指標となります。LC-MSでは5 ppb未満のTOC濃度が推奨されていますが、これはMilli-Q®超純水システムによって達成されます。
図2。水道水および梱包直後のMilli-Q®超純水中のエストラジオールのMRMクロマトグラム（ESI+）。 エストラジオールのマルチプルリアクションモニタリング（MRM）ESI+トランジションには、プリカーサーイオン 273 m/z およびフラグメントイオン 255 m/z を用いた。LC-MS分析は、Agilent® 1290 Infinity HPLCシステムとAgilent® 6420トリプル四重極システム（ESI+、MRM）を連結して行った。 ホルモンの分離には、Purospher® STAR RP-18 エンドキャップ処理（2 µm）Hibar® HR 50-2.1 カラムを用い、グラジエント溶出条件下で分離を行った。
精製水の長期保存は、LC-MS分析に不純物をもたらす
超純水が浄水システムから分注されると、実験室環境や保存に用いる容器によって、すぐに汚染される可能性があります。このため、可能な限り、必要に応じてその都度、精製したばかりの超純水を使用することが最善です。
プラスチック製の容器は通常、有機化合物（可塑剤など）や一部のイオンを溶出させる一方、ガラス瓶は有機物の溶出は少ないものの、それでもイオンを溶出させる可能性があります。さらに、超純水を保存していると、時間の経過とともに細菌の増殖が促進され、有機汚染物質が放出される可能性があります。図3は、開封後の保存がLC-MS用水の純度に悪影響を及ぼす様子を示しています。
これらの影響を最小限に抑えるため、LC-MS分析用の水は、ガラス瓶（できればホウケイ酸ガラス瓶）に保管し、保管期間を可能な限り短くする必要があります。
図3。(A) 総有機炭素（TOC）が 5 ppb 未満、比抵抗が 18.2 MΩ・cmの抵抗率を有する、0.22 μmの最終フィルター（Millipak®）を備えたMilli-Q®超純水精製システムから生成された（A）製造直後のMilli-Q®超純水と、開封後4週間保管した競合他社BのLC-MSグレード水との質量スペクトルの比較。分析は、ESI陽イオンモードで動作するMSに溶媒を直接注入して実施した。出典：『LC-MSにおける水質の向上に向けた4つの方法』.3
LC-MS用純水の仕様
液体クロマトグラフィー・質量分析（LC-MS）を扱う研究者のニーズに合わせた、さまざまな水浄化ソリューションをご用意しています。
比抵抗18.2 MΩ・cm、TOCが5 ppb未満の、精製されたばかりの超純水（タイプ1）は、高い分析感度と精度を実現し、信頼性が高く再現性のあるLC-MS測定結果を得るために不可欠です。 TOCモニターまたはインジケーターを備えた水浄化システムを選択することで、LC-MSで使用される水に、分析を妨げデータの精度に影響を与える可能性のある有機汚染物質が含まれていないことを確実に保証できます。TOC値により、水の純度がリアルタイムで確認できるため、分析に支障をきたす前に是正措置を講じることが可能です。
微量および超微量の有機物のLC-MS分析に適した水を提供するため、当社はLC-Pak®ポリッシャーを開発しました。このポリッシャーには粒状C18逆相シリカが充填されており、Milli-Q® Type 1超純水システムの給水口に設置可能です。これにより、LC-MSおよびLC-MS/MS用に、精製されたばかりの超純水を効率的かつ便利に利用することができます。