중합효소 연쇄 반응

중합효소 연쇄 반응(PCR)¹⁻³은 분자 생물학 분야에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나가 되었다. 기초 연구부터 대량 스크리닝에 이르기까지 다양한 분야에서 활용된다. 강력한 기술임에도 불구하고, 보편적인 채택과 광범위한 적용 범위는 명백한 단순성과 상대적으로 낮은 비용 덕분이다. 이 기술은 소량의 원본 DNA 또는 RNA(역전사 단계를 거쳐 상보적 DNA(cDNA)를 생성한 후, 역전사 참조)로부터 특정 표적 DNA 단편을 증폭하는 데 사용됩니다. PCR의 주요 장점 중 하나는 템플릿이 분해되거나 억제제로 오염된 경우에도 시작 물질의 단일 사본으로부터 표적 서열을 증폭할 수 있다는 점이다. 예를 들어, 고대 이집트 미라에서 추출한 DNA를 이용해 투탕카멘 왕의 가족 구성원을 확인하는 연구가 수행된바 있다⁴. PCR은 다소 과장되게 묘사되기는 하지만, 주요 영화와 대부분의 범죄 수사 드라마에서도 "수사" 과정의 어느 단계에서든 등장한다.

PCR 사이클링 과정

일반적인 PCR은 다음과 같은 단계로 구성됩니다:

• 초기 변성: 반응 온도를 95°C로 올리고 2~5분간(효소 특성과 템플릿 복잡도에 따라 최대 10분까지) 반응을 배양하여 모든 복잡한 이중가닥 DNA(dsDNA) 분자가 증폭을 위해 단일 가닥으로 분리되도록 합니다.
  
  
• 사이클링:
  
  
  1. 변성: 반응 온도를 95°C로 올려 모든 dsDNA를 녹여(상보적 염기 사이의 수소 결합을 끊어) 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분해합니다.
     
  2. 애닐링: 온도를 프라이머의 용융점(_Tm)보다 약 5°C 낮은 수준(보통 45–60°C)으로 낮추어 프라이머가 템플릿에 결합하도록 촉진합니다.
     
  3. 연장: 온도를 72°C로 상승시킵니다. 이는 DNA 중합효소 활성에 최적화된 온도로, 결합된 프라이머가 연장될 수 있도록 합니다.
     

• 반복: 단계 1~3을 주기적으로 수행하여 증폭 산물이 기하급수적으로 증폭됩니다(그림 2.1 및 2.2).

PCR은 반응 가열 및 냉각의 주기로 구성됩니다. 각 온도 평형 단계는 반응의 정의된 단계를 제어하는 데 사용되며, 배양 시간은 기기, 반응 플레이트 또는 튜브 및 시약에 따라 달라집니다. 특히 검출 감도를 높여야하는 경우, 각 실험에 대해 이를 최적화해야합니다5.

초기 변성 단계는 고온에서 진행되며, 이 기간 동안 복잡한 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 이차 구조가 녹아 단일 가닥 DNA(ssDNA)가 됩니다. DNA가 고온에 노출되므로, 이 단계는 모든 가닥이 분리되어 프라이밍에 활용될 수 있을 만큼 충분히 길어야 하지만, DNA가 손상될 정도로 길어서는 안 됩니다. 초기(또는 후속) 변성 단계에서의 분해 또는 불완전한 변성은 검출감도 저하를 초래합니다⁵.

사이클링을 시작하는 더 짧은 변성 단계(95°C에서 10초~1분) 동안, 표적 서열의 DNA 가닥은 초기 변성 단계와 마찬가지로 분리되어 단일 가닥을 형성합니다. 이후 반응은 프라이머 결합 온도로 냉각됩니다.

애닐링 단계(45~60°C에서 30초~1분)는 프라이머가 각 DNA 단일 가닥의 상보적 서열에 결합하도록 하기 위해 필요합니다. 프라이머는 관심 대상 서열을 양쪽에서 감싸도록 설계되며, 이 둘 사이에 위치한 서열 영역을 증폭산물(amplicon)이라 부릅니다. 일반적으로 어닐링 온도는 프라이머-템플릿 DNA 이중나선의 용융 온도보다 약 5°C 낮게 추정됩니다.

최종 단계는 연장 단계(72°C에서 20초~1분)로, DNA 중합효소가 각 프라이머의 3' 말단에서 증폭체 끝까지 프라이머 서열을 연장하도록 수행됩니다. 일반적으로 1분 연장으로 최대 2킬로베이스(kb)의 PCR 단편을 합성하는 데 충분합니다. 더 큰 단편을 증폭하려면 연장 단계를 kb당 1분씩 연장합니다. 첫 번째 연장 단계에서는 템플릿이 길이 제한 요소가 아니므로 증폭체 길이를 초과하는 템플릿이 합성됩니다. 이후 연장 단계에서는 증폭체 길이가 양쪽 끝의 프라이머 서열에 의해 결정됩니다.

두 번째 사이클 시작 시, 반응에는 두 형태의 템플릿이 존재한다: 원본 DNA 가닥과 새로 합성된 DNA 가닥으로, 이 가닥들은 프라이머 서열에 이어 3' 말단에서 연장된 가변 길이의 증폭 산물로 구성된다. 첫 번째 사이클에서 프라이밍되지 않은 잔여 원본 DNA 가닥은 두 번째 사이클에서 포착되어 프라이머와 연장 산물로 구성된 분자를 생성할 수 있습니다. 첫 번째 사이클에서 프라이밍 및 연장된 분자들은 새로 합성된 물질과 상보적인 프라이머의 템플릿이 됩니다.

세 번째 사이클에서는 두 번째 사이클에서 새롭게 합성된 표적 영역 DNA가 증폭산물만으로 구성되므로 특정 템플릿이 됩니다.

이 사이클링이 지속적으로 반복되면서 복제된 서열이 기하급수적으로 증폭됩니다(그림 2.2). 필요한 사이클 수는 원하는 PCR 산물의 수율에 따라 달라지며, 이는 다시 초기 시작 사본 수와 증폭 효율에 달려 있습니다. 시작 물질과 최종 산물의 상대적 농도 차이는 극도로 크다(예: 단일 분자가 40회 증폭을 거치고 각 사이클에서 100% 효율을 달성할 경우 1/5.511, 그림 2.1). 따라서 반응 종료 시 생성된 DNA는 거의 전적으로 PCR 증폭산물이다.

이론상 PCR은 지속적인 지수적 증폭을 보여야 하지만, 반응은 결국 평탄화 단계에 도달합니다. 이는 DNA 중합효소가DNA 산물에 비특이적으로 결합하기 때문으로보입니다6,7. 이는 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 형광 표지자의 변화를 모니터링할 때 명확히 관찰됩니다( 정량적 PCR 참조).

반응 종료 시 증폭 산물은 겔 전기영동으로 분석한다. 생성된 양과 증폭된 단편의 크기에 따라, 반응 산물은 에티디움 브로마이드로 겔을 염색하여 직접 시각화하거나(그림 2.3) BlueView^™ 8과 같은 최근 도입된 염료를 사용하여 확인할 수 있다.

PCR 분석 구성 요소

아래는 PCR에 필요한 구성 요소의 요약입니다. 이들 중 상당수는 본 가이드 말미의 상세한 표준 PCR 프로토콜(부록 A)뿐만 아니라 전용 장에서도 추가적으로 자세히 설명되어 있습니다.

템플릿

RNA 및 DNA 정제를 위한 여러 방법이 존재합니다. 이들 모두 적합하지만, 그 효과가 동일하지 않을 수 있습니다. 샘플 원천의 다른 물질로 인한 템플릿 오염은 PCR 억제를 초래할 수 있으며, 극단적인 경우 분석 실패로 이어질 수 있습니다. 오염 물질이 오히려 반응증강을 유발할 수 있다는 사례도 보고된 바 있습니다9,10. 템플릿 정제 및 품질 관리에 대한 자세한 내용은 '샘플 정제 및 품질 평가'를, 역전사(RT) 반응 관련 정보는 '역전사' 항목을 참조하십시오. 일반적으로 20~100μL PCR 분석에 10ng~1μg의 게놈 DNA(gDNA)를 첨가하는 반면, cDNA 합성 반응은 1/5~1/10로 희석하여 5μL를 20~50μL 반응에 첨가합니다.

프라이머

올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로 15~25 뉴클레오티드 길이로, GC 함량이 40~60%이며 각 쌍의_Tm이 유사합니다.
쌍의 각 구성원마다 유사한_Tm을 가집니다. 짧은 올리고(25 염기 미만)의_Tm을 평가하는 간단한 방법은다음 공식을 사용하는 것입니다:

_Tm = 4(G + C) + 2(A + T)

프라이머 설계 및 취급에 대한 자세한 내용은 PCR/qPCR/dPCR 분석 설계 항목을 참조하십시오. 이상적인 어닐링 시작 온도는 용융 온도보다 약 5°C 낮게 설정하는 것이 좋습니다. 어닐링 온도는 온도 구배 PCR 블록을 사용하여 최적화할 수 있습니다. 온도 최적화 프로토콜(qPCR 예시)은 부록 A에 제시되어 있습니다.

DNA 중합효소

다양한 DNA 중합효소가 존재하며, 실험 목적에 따라 적절한 효소를 선택하는 것이 중요합니다(단순히 실험실 냉동고에 있는 효소를 사용하는 것이 아닙니다). 예를 들어, 일부 효소는 저온에서 비활성화되도록 설계되어 비특이적 증폭을 줄이기 위한 핫스타트 프로토콜에 사용되며, 다른 효소는 오류율이 낮아 클로닝용 단편 증폭에 선택됩니다.

dNTPs

PCR에서 각 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)의 농도는 일반적으로 200 μM입니다. 그러나 dNTP 농도는 과잉이어야 하며, 긴 단편이나 매우 풍부한 표적의 증폭을 위해서는 농도를 높여야 할 수도 있습니다. 최근에는Clean Amp^™ dNTPs12와 같은 PCR 버퍼 성분이 개선되었습니다. 이들은 DNA 중합효소의 뉴클레오티드 통합을 차단하는 변형된 뉴클레오사이드 삼인산염입니다. CleanAmp dNTP는 일반적인 핫 스타트 사이클링 조건에서 초기 가열 단계 및 후속 변성 단계에 의해 활성화됩니다. 이 과정은 PCR의 각 사이클 동안 이용 가능한 활성화된 dNTP의 양을 제한하여 원하는 산물의 더 특이적이고 효율적인 증폭을 가능하게 합니다. 결과적으로, 이는 잘못된 프라이밍이나 프라이머 다이머 형성을 줄이거나 완전히 방지하므로 핫 스타트 DNA 중합효소의 대안이 됩니다.

_MgCl2 농도

자유Mg²⁺ 이온은 DNA 중합효소 활성의 보조인자로 필요하지만,Mg²⁺ 이온은 dNTP, 프라이머 및 DNA 템플릿과 복합체를 형성합니다. 따라서 각 실험마다 최적의_MgCl₂ 농도를 선택하기 위해 다양한 농도를 포함한 반응을 테스트해야 합니다._MgCl2 농도는 일반적으로 1.5~5.5 mM 사이이지만, 최적화 과정에서는 1~8 mM 범위에서 테스트할 수 있습니다( 분석법 최적화 및 검증 참조).

형광 표지

qPCR 또는 디지털 PCR(dPCR) 설정을 사용하는 경우와 같이 증폭 산물을 직접 검출해야 할 때 형광 염료가 반응에 포함됩니다. 이러한 염료는 완충액에 포함되거나 프라이머 또는 추가 프로브에 부착됩니다( 정량적 PCR 및 디지털 PCR 검출 방법 참조).

기기

원래 PCR 수행은 노동 집약적이었는데, 이는 변성, 어닐링, 연장 단계에 각각 필요한 온도로 설정된 3개의 수조 사이에서 반응 튜브를 물리적으로 이동시켜 수행했기 때문입니다. 증발을 방지하기 위해 반응 상단에 오일을 첨가했으며, 오일의 간섭 없이 분석을 수행하기는 까다로웠습니다. 오늘날에는 시판되는 다양한 전용 열순환 장비 중 하나를 사용하는 것이 일반적입니다. 플레이트 및 블록 형식은 48, 96 또는 384웰로 다양하며 다중 채널 피펫과 호환됩니다. 대부분 오일 오버레이가 필요 없는 가열식 뚜껑을 사용합니다. 그러나 원래수조 원리에 기반한 고처리량 장비도 존재합니다13.

응용 분야별 PCR 변형

다양한 PCR 파생법은 반응 수정이 필요합니다. 여기에는 널리 사용되는 응용 분야를 위한 일부 수정 사항이 포함됩니다.

클로닝

PCR은 벡터 삽입을 위한 선택적 서열 증폭에 사용될 수 있습니다. 이러한 서열은 클로닝 효소 인식 부위(꼬리)를 포함하도록 수정될 수 있습니다. 벡터에 이미 클로닝된 단편을 분리하기 위해 벡터 특이적 프라이머를 사용합니다. PCR 단계에는 오류율이 낮은 DNA 중합효소가 필요합니다.

서열 태그 부위

이들은 프라이머의 5' 말단에 설계되며, 특정 샘플 게놈의 특정 세그먼트가 선택된 클론에 존재한다는 지표로 특정 태그가 필요한 대량 시퀀싱 과정에서 사용됩니다. 이를 통해 게놈 서열 데이터를 분리하여 원래의 출처 샘플에 귀속시킬 수 있습니다.

위치 특이적 돌연변이 유도

단백질 기능을 연구하기 위해 DNA 서열에 원하는 돌연변이를 도입할 수 있습니다. 원하는 염기 변이는 프라이머(5' 말단 쪽)에 설계되며, 여기에는 필요한 클로닝 효소 제한 부위도 포함됩니다. 다른 접근법은 다단계 프로토콜을 채택하여, 표적에 특이적이고 클로닝 부위를 포함하는 프라이머를 원하는 돌연변이를 포함하는 프라이머와 함께 사용합니다.