RIPAb+ HuR Conjunto de anticuerpos y cebadores validados para RIP

35 kDa

Los anticuerpos RIPAb+ se evalúan mediante el análisis de inmunoprecipitación de las proteínas de unión al ARN (RIP). Cada conjunto de anticuerpos RIPAb+ incluye cebadores de control para RT-PCR cuantitativa (cebadores RIP) para validar biológicamente los resultados de la IP mediante la coprecipitación satisfactoria de una diana de ARN específica (si se conoce dicha diana específica). Se proporcionan el protocolo de qPCR y las secuencias de los cebadores, lo que permite a los investigadores validar los protocolos de RIP al utilizar nuestro anticuerpo en su contexto experimental. Cada conjunto incluye también un anticuerpo de control negativo para garantizar la especificidad de la reacción RIP.
El conjunto RIPAb+ Hur consta del anticuerpo HuR, un anticuerpo de control negativo (IgG de conejo purificada) y cebadores positivos para qPCR que amplifican un fragmento de 100 bp del ADNc de la beta actina humana (ACTB). El HuR y los anticuerpos de control negativos se suministran en un tamaño de reacción escalable «por RIP» y pueden utilizarse para validar funcionalmente la precipitación de los ARN asociados a HuR.

Epítopo: a.a. 1-13 de la HuR

Este conjunto de cebadores y anticuerpos RIPAb+ HuR validados con RIP consiste en el anticuerpo y los cebadores de control específicos para PCR.

Inmunoprecipitación de lisado RIP:
El lisado RIP de las células MCF7 (2 X 10⁶ equivalentes de células por IP) se sometió a inmunoprecipitación con 0,5 μg de IgG normal de conejo o anticuerpo anti-HuR. Las proteínas precipitadas se resolvieron por electroforesis, se transfirieron a nitrocelulosa y se probaron con anti-HuR (1,0 μg/ml).
Las proteínas se visualizaron utilizando el kit One-Step IP-Western (GenScript nº ref. L00231) (Ver figuras).

Análisis mediante inmunoelectrotransferencia (WB):
El lisado 3T3/A31 se resolvió por electroforesis, se transfirió a membranas de PVDF y se analizó con HuR, hu (dilución 1:500). Las proteínas se visualizaron utilizando un anti-conejo de burro conjugado con HRP y un sistema de detección mediante quimioluminiscencia. (Ver figuras).

Análisis de inmunoprecipitación:
10 µg de este anticuerpo causó inmunoprecipitación del HuR de 500 µg de lisado RIPA 3T3/A31 (ver figuras).

Análisis mediante inmunocitoquímica:
Análisis mediante IF confocal de HeLa, NIH/3T3 utilizando anti-HuR (rojo). Los filamentos de actina se han marcado con AlexaFluor 488-faloidina (verde). El núcleo se tiñe con DAPI (azul) (ver las figuras).

Anti-HuR (policlonal de conejo). Un vial que contiene 50 μg de policlonal de conejo purificado en 100 μl de tampón compuesto por PBS en azida sódica al 0,05 % con glicerol al 50 %. Líquido a -20°C.

IgG normal de conejo. Un vial que contiene 125 μg de IgG purificada de conejo en 125 μl de tampón de conservación que contiene azida sódica al 0,1 %. Conservar a -20°C.

Cebadores para RIP, ACTB. Un vial que contiene 75 μl de 5 μM de cada cebador específico para la beta actina humana (ACTB). Conservar a -20°C.
DIR: TTG TTA CAG GAA GTC CCT TGC C
INV: ATG CTA TCA CCT CCC CTG TGT G

Presentación: Purificada

Control
Incluido control negativo de anticuerpos IgG de conejo y control de cebadores específicos para la beta actina humana (ATCB).

Inmunoprecipitación de proteínas de unión al ARN:
El lisado de células HeLa (2 x 10⁷ equivalentes de células por IP) preparado para RIP se sometió a inmunoprecipitación utilizando 5 µg de un anticuerpo IgG de conejo normal o un anticuerpo anti-HuR y el kit para RIP Magna (ref.17-700).
La inmunoprecipitación exitosa del ARN asociado al HuR se verificó mediante qPCR utilizando cebadores para RIP, ACTB (véanse las figuras).
Véanse los detalles experimentales en el protocolo de Magna RIP^® (Nº de ref. 17-700) o EZ-Magna RIP (Nº de ref. 17-701).

MAGNA RIP is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

UPSTATE is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany