ADN polimerasa Tth

La ADN polimerasa Tth se aísla de la eubacteria termófila Thermus thermophilus HB8 y se purifica para que carezca de DNasas y ARNasas inespecíficas. La enzima es una ADN polimerasa 5′-3′ muy activa y carece de actividad exonucleasa 3′-5′. La enzima presenta su mayor actividad a un pH de aproximadamente 9 (ajustado a +25°C), y temperaturas alrededor de +75°C. Es resistente a incubaciones prolongadas a elevadas temperaturas (+95°C).

La ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) podría utilizarse:

• para amplificar fragmentos de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) debido a su resistencia a incubaciones prolongadas a elevadas temperaturas (95 °C)
• para marcar fragmentos de ADN con nucleótidos marcados radiactivamente, digoxigenina o biotina, ya que esta enzima acepta desoxirribonucleótidos modificados como sustratos
• para la transcripción eficaz de ARN específicos en ADNc debido a su actividad transcriptasa inversa (RT) intrínseca dependiente de Mn
• para PCR en tiempo real

La ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) es una ADN polimerasa termoestable con actividad transcriptasa inversa (RT) intrínseca. La enzima es una ADN polimerasa 5′-3′ muy activa y carece de actividad exonucleasa 3′-5′ (pruebas de lectura). Se encontró que posee una actividad transcriptasa inversa (RT) intrínseca muy eficiente en presencia de iones de manganeso, mucho más alta que la demostrada por la ADN polimerasa I de Escherichia coli y la ADN polimerasa Taq. La actividad RT no está asociada con la actividad ARNasa H. Las elevadas temperaturas de actividad de la ADN polimerasa Tth (óptima de +55°C a +70°C, máxima +95°C) superan los problemas planteados por la estructura secundaria del ARN. El ADNc resultante puede amplificarse mediante PCR utilizando la misma enzima en presencia de iones Mg²⁺. La capacidad de la ADN polimerasa Tth para realizar tanto la transcripción inversa como la amplificación del ADN a temperaturas elevadas permite que esta enzima se utilice para RT-PCR cuantitativa, clonación y análisis de la expresión génica del ARN celular y vírico. La ADN polimerasa Tth se utiliza para la amplificación de ARN de hasta 1 kb mediante RT-PCR.

La ADN polimerasa Tth:

• Garantiza un tamaño optimizado del producto de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mínimo de hasta 1.000 pb en una reacción de RT-PCR
• Acepta trifosfatos de desoxirribonucleósidos modificados como sustratos
• No tiene asociación con la actividad de ARNasa H.
• Tiene una alta termoestabilidad para superar el problema normalmente asociado con el alto grado de estructura secundaria presente en el ARN

1 kit que contiene 3 componentes

La actividad de cada lote de ADN polimerasa Tth se analiza en ADN activado. Una prueba de la función se realiza utilizando ?ADN, así como el ADN genómico humano. Su rendimiento en la RT/PCR se analiza utilizando ARN total de ratón y cebadores específicos de la ?-actina. En cada lote de la ADN polimerasa Tth se prueba la ausencia de actividades contaminantes como actividades exonucleasas y endonucleasas y melladora de acuerdo con los procedimientos de control de calidad vigentes. Un ensayo de autocebado único garantiza la ausencia de ADN contaminante de acuerdo con los procedimientos actuales de control de calidad.

Sólo para investigación en ciencias de la vida. No indicada para procedimientos de diagnóstico.

Una unidad de ADN polimerasa Tth se define como la cantidad de enzima que cataliza la incorporación de 10 nmol de trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) totales en ADN precipitable en ácido en 30 minutos a +70 °C en las condiciones de ensayo indicadas en el «valoración unitaria».

Valoración unitaria: Tampón de incubación para análisis en ADN activado
Tris-HCI 67 mM, pH 8,8 (+25 °C), (NH₄)₂SO₄16,6 mM, MgCl₂ 6,7 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM, dATP, dCTP, dGTP, DTTP 0,2 mM cada uno.

Procedimiento de incubación
Se incuban 12,5 μg de ADN de esperma de arenque activado y 0,1 μCi de [α³²P] dCTP con 0,01 a 0,1 unidades de ADN polimerasa Tth en 50 μl de tampón de incubación con una capa de aceite de parafina a +70 °C durante 30 minutos.
La cantidad de dNTP incorporados se determina mediante precipitación con ácido tricloroacético seguida de recuento por centelleo.

Volumen de actividad: 0,5 a 5 U por reacción de PCR (óptima)
2,5 U por reacción de PCR (estándar)
Determinado en el análisis en ADN activado descrito en "valoración unitaria".

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