Kit de síntesis de la cadena primaria del ADNc para RT-PCR (AMV)

El kit de síntesis de la cadena primaria del ADNc se utiliza para la síntesis de la hebra primaria del ADNc como la reacción de partida para la retro-PCR en dos etapas. El kit consta de la transcriptasa inversa del AMV para la síntesis de la cadena primaria, dos cebadores diferentes, nuestra mezcla de nucleótidos para PCR y el Control Neo pa RNA. Los productos de PCR que se generan mediante la retro-PCR pueden clonarse utilizando procedimientos convencionales.

La amplificación del ARN requiere la conversión del sustrato ARN en ADN. Esto se consigue utilizando una transcriptasa inversa, como la AMV RT (transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar) o la M-MuLV RT (transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina Moloney). El ADNc resultante puede utilizarse como plantilla para una PCR convencional.
La AMV RT sintetiza la nueva hebra de ADNc en zonas que vienen determinadas por el tipo de cebador utilizado:

• en el extremo 3′ del ARNm poli/A) cuando se utiliza como cebador el Oligo-p(dT)₁₅,
• en puntos inespecíficos a lo largo del molde de ARNm cuando se utiliza el cebador aleatorio p(dN)₆ o
• en un sitio determinado por un cebador de secuencia específica.

La utilización de la AMV RT para la síntesis de la cadena primaria del ADNc tiene ciertas ventajas. La mayor termoestabilidad de esta enzima en comparación con la transcriptasa inversa de M-MuLV permite la realización de la reacción a +42°C, lo que proporciona una mayor especificidad y una mejor resolución de las estructuras secundarias en comparación con una reacción realizada a +37°C.

El kit de síntesis de la cadena primaria del ADNc para RT-PCR (AMV) es adecuado para:

• Detección de la presencia o ausencia de virus ARN u otros microorganismos que contengan ARN (en combinación con la PCR)
• Cuantificación del ARNm para supervisar la expresión diferencial de un ARNm específico
• La primera etapa de la «presentación diferencial del ARNm»
• Generación de bancos de ADNc con insertos largos y de longitud completa
• Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa-cuantitativa (RT-qPCR) para la transcripción inversa del ARN en ADN complementario.

Inactivación por calor: 5 min, 95 °C
Transcriptasa inversa AMV

Solidez:

• Transcribe el ARN total, el ARNm y el ARN vírico junto con estructuras de ARN secundarias difíciles de transcribir
• Obtiene transcritos del ADNc de hasta 12 kb
• Mayor termoestabilidad (hasta 50 °C) y especificidad que la transcriptasa inversa M-MuLV
• No es necesaria la purificación del ADNc resultante antes de la reacción de PCR

Flexibilidad:
Puede utilizarse con cebadores específicos de secuencia, cebadores poli(dT)15 o cebadores aleatorios, p(DN)6

1 kit que contiene 10 componentes.

En el análisis convencional de síntesis de ADNc, se sintetizan como mínimo 300 ng de ADNc (es decir, un rendimiento del 30 %) cuando se incuba 1,0 μg del molde Neo pa RNA con 20 μCi [α-³²P]-dCTP (actividad específica de 3000 Ci/mmol) durante 60 minutos a +42°C.

Sólo para investigación en ciencias de la vida. No indicada para procedimientos diagnósticos.

Volumen de actividad: de 20 a 25 U/μl