HPLC pour molécules de grande taille

HPLC
en phase inverse pour les biomolécules

La HPLC en phase inverse (RP-HPLC) est une technique sensible et polyvalente utilisée pour séparer et analyser des protéines, des fragments de protéines et des peptides. La RP-HPLC utilise une phase stationnaire non polaire et une phase mobile polaire. La rétention des protéines et des peptides sur la phase stationnaire obéit aux principes d’adsorption et de partitionnement. Les régions hydrophobes des protéines se fixent de manière réversible à la phase stationnaire. Les protéines sont éluées en augmentant le caractère non polaire de la phase mobile. La résolution peut être influencée par la taille des pores, la taille des particules, la longueur de la colonne et la chaîne hydrocarbonée liée à la phase stationnaire.

Chromatographie d’exclusion stérique (SEC)

La chromatographie d'exclusion stérique (SEC) est un mode de chromatographie non dénaturant qui sépare les molécules en fonction de leur taille (c'est-à-dire leur rayon hydrodynamique). Ce mode ne repose pas sur l'interaction de l'analyte avec la phase stationnaire, mais plutôt sur l'écoulement aléatoire de l'analyte à travers les particules de la phase stationnaire. Les analytes de haut poids moléculaire sont élués plus tôt, car ils sont totalement ou partiellement exclus des pores des particules de la phase stationnaire, tandis que les analytes de faible poids moléculaire sont élués plus tard, puisqu'ils passent plus de temps à parcourir le chemin sinueux à travers la particule. La SEC a été utilisée pour caractériser les agrégats et les fragments d'anticorps monoclonaux (mAbs), estimer les poids moléculaires de protéines inconnues et déterminer la stabilité des formulations protéiques.

Chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC)

La chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC) est un mode de chromatographie qui sépare les analytes en fonction du degré d’interaction entre les fragments hydrophobes de l’analyte et les ligands hydrophobes de la phase stationnaire. En raison de leur faible masse moléculaire et de leur faible propension au repliement, la HIC n’est généralement pas utilisée pour la séparation des peptides. À des concentrations élevées en sel, les couches d’hydratation des protéines peuvent être suffisamment perturbées pour que les régions de surface hydrophobes entrent en contact avec la phase stationnaire non polaire. Le choix des sels est dicté par la série de Hofmeister, qui classe les cations et les anions en fonction de leur capacité à perturber les couches d’hydratation des protéines (chaotropes) ou à favoriser leur formation (cosmotropes). Parmi les sels couramment utilisés, on trouve le sulfate d’ammonium, le sulfate de potassium et le sulfate de sodium. La chromatographie d’interaction hydrophobe est actuellement utilisée pour déterminer le profil du rapport médicament/anticorps (DAR) des conjugués anticorps-médicament (ADC).

Chromatographie d’échange d’ions (IEX)

La chromatographie d’échange d’ions (IEX) est un mode de chromatographie qui sépare les analytes en fonction de leur charge. Les protéines et les peptides sont amphotères, ce qui signifie qu’ils présentent à la fois des fonctionnalités acides et basiques. Les fonctionnalités acides des protéines comprennent l’acide aspartique, l’acide glutamique, la cystéine, la tyrosine et le groupe α-carboxylate C-terminal. Les fonctionnalités basiques des protéines comprennent l’arginine, l’histidine, la lysine et le groupe α-amine N-terminal. Les variants de charge des produits biothérapeutiques peuvent être détectés et séparés par IEX. Ces variants de charge peuvent résulter d’une erreur de traduction de l’ARN messager (ARNm) et/ou de modifications post-traductionnelles, telles que la désamidation, l’oxydation ou la glycosylation.

Le choix d’une colonne IEX doit se faire en fonction du point isoélectrique (pI) de l’analyte. Si le pH de la phase mobile est inférieur au pI, l’analyte sera chargé positivement et se liera à une colonne d’échange cationique. Si le pH de la phase mobile est supérieur au pI, l’analyte sera chargé négativement et se liera à une colonne d’échange anionique.

Chromatographie d’affinité

La chromatographie d’affinité repose sur une interaction spécifique entre un analyte et un ligand de la phase stationnaire. Idéalement, seul l’analyte d’intérêt interagit avec la phase stationnaire, ce qui permet à tous les autres composants de l’échantillon de traverser la colonne. Une deuxième phase mobile est ensuite fait passer à travers la colonne pour éluer l’analyte.

La chromatographie sur protéine A est la forme la plus courante de chromatographie d'affinité utilisée dans l’industrie biopharmaceutique. La protéine A est une protéine de surface de 42 kDa présente dans la paroi cellulaire de S. aureus. Cette protéine se lie spécifiquement à la chaîne lourde dans la région Fc des IgG, ce qui en fait un mécanisme idéal pour séparer les IgG des autres composants de l’échantillon.  La plupart des colonnes de protéine A sont fabriquées en immobilisant la protéine sur une particule organique poreuse. Cependant, un format monolithique a été mis au point pour la chromatographie sur protéine A, permettant un débit élevé d'échantillons à différents débits, sans compromettre l'efficacité.