HPLC pour grandes molécules

La CLHP à phase inversée pour les biomolécules

La CLHP à phase inversée (CLHP-PR) est une technique sensible et polyvalente utilisée pour séparer et analyser les protéines, les fragments de protéines et les peptides. La CLHP-PR utilise une phase stationnaire non polaire et une phase mobile polaire. La rétention des protéines et des peptides sur la phase stationnaire suit les principes d'adsorption et de partitionnement. Les régions hydrophobes des protéines se fixent de manière réversible sur la phase stationnaire. Les protéines sont éluées en augmentant la nature non polaire de la phase mobile. La résolution peut être affectée par la taille des pores, la taille des particules, la longueur de la colonne et la chaîne d'hydrocarbures attachée à la phase stationnaire.

Chromatographie d'exclusion de taille (SEC)

La chromatographie d'exclusion de taille (SEC) est un mode de chromatographie non dénaturant qui sépare les molécules en fonction de leur taille (c'est-à-dire leur rayon hydrodynamique). Ce mode ne repose pas sur l'interaction de l'analyte avec la phase stationnaire, mais plutôt sur le flux aléatoire de l'analyte à travers les particules de la phase stationnaire. Les analytes de haut poids moléculaire sont élués plus tôt, car ils sont totalement ou partiellement exclus des pores des particules de la phase stationnaire, tandis que les analytes de faible poids moléculaire sont élués plus tard, car ils passent plus de temps à parcourir le chemin tortueux à travers la particule. La SEC a été utilisée pour caractériser les agrégats et les fragments d'anticorps monoclonaux (mAbs), pour estimer le poids moléculaire de protéines inconnues et pour déterminer la stabilité de la formulation des protéines.

Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)

La chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC) est un mode de chromatographie qui sépare les analytes en fonction du degré d'interaction entre les groupements hydrophobes de l'analyte et les ligands hydrophobes de la phase stationnaire. En raison de leur faible poids moléculaire et de leur faible propension au repliement, la chromatographie HIC n'est généralement pas utilisée pour la séparation des peptides. À des concentrations élevées de sel, les couches d'hydratation des protéines peuvent être suffisamment perturbées pour que les régions hydrophobes de la surface soient en interface avec la phase stationnaire non polaire. Le choix du sel est dicté par la série de Hofmeister, qui classe les cations et les anions en fonction de leur capacité à perturber les couches d'hydratation des protéines (chaotropique) ou à favoriser la formation de couches d'hydratation des protéines (kosmotropique). Les sels typiques sont le sulfate d'ammonium, le sulfate de potassium et le sulfate de sodium. La chromatographie d'interaction hydrophobe est actuellement utilisée pour déterminer le profil du rapport médicament/anticorps (DAR) des conjugués anticorps/médicaments (ADC).

Chromatographie d'échange d'ions (IEX)

La chromatographie d'échange d'ions (IEX) est un mode de chromatographie qui sépare les analytes en fonction de leur charge. Les protéines et les peptides sont amphotères, c'est-à-dire qu'ils présentent à la fois des fonctions acides et basiques. Les fonctions acides des protéines comprennent l'acide aspartique, l'acide glutamique, la cystéine, la tyrosine et l'α-carboxylate de l'extrémité C. Les fonctions basiques des protéines comprennent l'arginine, l'acide linoléique, l'acide linoléique et l'acide linoléique. Les fonctions protéiques de base comprennent l'arginine, l'histidine, la lysine et l'α-amine de l'extrémité N. Les variantes de charge biothérapeutiques peuvent être détectées et résolues par IEX. Les variants de charge peuvent provenir d'une mauvaise transcription de l'ARN messager (ARNm) et/ou de modifications post-traductionnelles, telles que la désamidation, l'oxydation ou la glycosylation.

Une colonne IEX doit être sélectionnée en fonction du point isoélectrique (pI) de l'analyte. Si le pH de la phase mobile est inférieur au pI, l'analyte sera chargé positivement et se liera à une colonne d'échange de cations.Si le pH de la phase mobile est supérieur au pI, l'analyte sera chargé négativement et se liera à une colonne d'échange d'anions.

Affinity Chromatography

La chromatographie d'affinité repose sur une interaction spécifique entre un analyte et un ligand de la phase stationnaire. Dans l'idéal, seul l'analyte concerné entre en contact avec la phase stationnaire, ce qui permet à tous les autres composants de l'échantillon de passer à travers la colonne. La chromatographie de la protéine A est la forme la plus courante de chromatographie d'affinité utilisée dans l'industrie biopharmaceutique. La protéine A est une protéine de surface de 42 kDa que l'on trouve dans la paroi cellulaire de S. aureus.Cette protéine se lie spécifiquement à la chaîne lourde de la région Fc des IgG, ce qui en fait un mécanisme idéal pour séparer les IgG des autres composants de l'échantillon. La plupart des colonnes de protéine A sont fabriquées en immobilisant la protéine sur une particule organique poreuse. Cependant, un format monolithique pour la chromatographie de la protéine A a été produit, permettant un débit d'échantillon élevé à différents taux de débit, sans sacrifier l'efficacité.

La protéine A est une protéine de surface de 42 kDa que l'on trouve dans la paroi cellulaire de S. aureus.