ARN polymérase SP6

Conserver le récipient bien fermé dans un endroit sec et bien ventilé

Activateur : BSA/spermine

Tampon de test :
Tris-HCl à 40 mM, pH 8,0 (+20 °C), MgCl₂ à 6 mM, dithiothréitol à 10 mM, spermidine à 2 mM, pH environ 8,0 (+20 °C).
Absence d'endonucléases
1. 1 μg d'ADN lambda est incubé avec l'ARN polymérase SP6 pendant 4 heures à +37 °C dans 25 μl de tampon de test. Le nombre d'unités d'enzyme qui ne montrent aucune dégradation de l'ADN lambda est de > 30 U.
2. 1 μg de fragments Eco RI/Hind III d'ADN lambda est incubé avec l'ARN polymérase SP6 pendant 4 heures à +37 °C dans 25 μl de tampon d'essai. Le nombre d'unités d′enzyme qui ne présentent pas d'altération du profil de bandes est de > 30 U.
Absence d'activité de coupure
1 μg d'ADN de pBR322 est incubé avec l'ARN polymérase SP6 pendant 4 heures à +37°C dans 25 μl de tampon de test. Le nombre d'unités d'enzyme qui ne montrent aucune dégradation de l'ADN lambda est de > 30 U.
Absence de RNases
4 μg d'ARN MS2 sont incubés avec de l′ARN polymérase SP6 pendant 4 heures à +37 °C dans 50 μl de tampon de test. Le nombre d'unités d′enzyme qui ne montrent aucune dégradation de l'ARN MS2 est de > 30.
Performance dans l′essai de transcription
La fonction de l'ARN polymérase SP6 est testée dans le kit de transcription SP6/T7 (N° ref 10 999 644 001). Le taux d'incorporation dans l'essai standard avec 0,5 μg d'ADN pST18 neo linéarisé avec Eco RI et 50 mCi [alpha-³²P] CTP, [400 Ci/mmol (15 TBq/mmol)] donne >50 % de la radioactivité introduite en 20 minutes.

L'ARN polymérase SP6 peut transcrire l'ARN à partir de modèles d'ADN clonés qui sont en aval d'un promoteur SP6. La synthèse peut être réalisée avec des NTPs marqués pour générer de l'ARN hautement marqué. L'ARN synthétisé peut être utilisé dans de nombreuses applications, notamment :

• Techniques de blotting d′ARN ou d′ADN
• Hybridation in situ
• Études de protection contre les RNases : les produits de tyranscription synthétisés par l'enzyme sont utilisés comme ARN précurseur pour des études sur l'épissage et la maturation de l'ARN.
• Synthèse d'ARN à coiffe in vitro avec ajout de m7GpppG ou m7GpppA en excès par rapport au GTP ou ATP pendant la réaction de transcription. L'ARN antisens produit peut être introduit dans les cellules pour supprimer l'expression des gènes correspondants.
• La synthèse de sondes d′ARN antisens

Spécificité de promoteur

L'ARN polymérase SP6 est extrêmement spécifique du promoteur et ne transcrit que l'ADN du bactériophage SP6 ou l'ADN cloné en aval d'un promoteur SP6 (p. ex.., pSPTBM20 ; pSPTBM21).

Inactivation par la chaleur : Arrêter la réaction en ajoutant 2 μl d'EDTA à 0,2 M (pH 8,0) et/ou en chauffant à 65 °C.

Synthèse de sondes d′hybridation : L'ARN polymérase SP6 permet une production très efficace d'ARN marqué de manière homogène. Cet ARN marqué peut être utilisé comme sonde d'hybridation dans les transferts de Southern, northern et dot, ainsi que dans les hybridations in situ.
Marqueurs appropriés : Les produits de transcription peuvent être marqués de manière non radioactive avec de la biotine-16-UTP, de la DIG-11-UTP ou de la fluorescéine-12-UTP. Ils peuvent également être marqués radioactivement à une activité spécifique élevée avec des nucléotides marqués au [a-³²P]- ou au [a-³⁵S].

Remarque : Roche propose des mélanges de marquage d'ARN concentrés 10x, spécialement conçus pour le marquage au DIG, à la biotine et à la fluorescéine. Ces mélanges fonctionnent bien avec l'ARN polymérase SP6.

Ce système permet de générer de l'ARN simple brin marqué de manière homogène. Les produits de transcription peuvent être marqués non radioactivement avec de la biotine ou du DIG-11-UTP ou marqués radioactivement à haute activité spécifique avec des nucléotides marqués au [α-³²P] ou au [α-³⁵S].

Contenu :

• ARN polymérase SP6, ≥20 U/μl, dans du tampon, pH 7,9
• Tampon d′incubation, concentré 10x

Produit destiné uniquement à la recherche en sciences de la vie. Ne pas utiliser dans des procédures de diagnostic.

Une unité correspond à l'activité enzymatique qui incorpore 1 nmol de CMP dans des produits ARN précipitables à l′acide en 60 minutes, à +37 °C.

Activité volumique : ≥20 U/μl