Kit Miniprep pour ARN total de mammifère GenElute^™

Le Kit Miniprep pour ARN total de mammifère GenElute^™ a été utilisé pour extraire de l′ARN total de cellules et de tissus.

L′ARN purifié est prêt pour la transcription inverse et la PCR, le marquage et l′analyse de puces, et d′autres applications courantes. Il est à noter que les ARN de moins de 200 nucléotides de long, comme l′ARNt, l′ARNr 5S et l′ARNr 5.8S, ne sont pas récupérés de manière efficace dans les conditions du kit.

Le Kit Miniprep pour ARN total de mammifère GenElute associe la technologie d′une membrane de silice et le format d'une colonne de centrifugation pour obtenir une méthode de fixation, de lavage et d′élution rapide, permettant de préparer de l′ARN total de grande qualité.

Les échantillons sont lysés et homogénéisés dans du thiocyanate de guanidine et du 2-mercaptoéthanol pour libérer l′ARN et inactiver les RNases. Les lysats sont centrifugés sur une colonne de filtration afin de retirer les débris cellulaires et de cisailler l′ADN. Le filtrat est ensuite placé sur une colonne de silice de grande capacité pour fixer l′ARN total, puis subit un lavage et une élution. Il est possible de récupérer jusqu′à 150 μg d′ARN total par préparation dans 100 μl d′eau. L′ARN purifié est alors prêt pour les analyses Northern blot (Fig. 1), RT-PCR (Fig. 2) et les autres applications courantes.

Le Kit Miniprep pour ARN total de mammifère GenElute′ de Sigma constitue un moyen simple et pratique pour isoler de l′ARN total à partir de cellules et de tissus. Des protocoles sont fournis pour les cellules, les tissus et les tissus fibreux. Ces protocoles diffèrent au niveau des conditions de lyse et de rupture des cellules. Une fois l′ARN retenu sur la colonne de fixation GenElute, la procédure de purification est la même quel que soit le matériel de départ. Pour les tissus fibreux, ajouter de la protéinase K (réf. P4850) au kit pour garantir une rupture efficace des cellules. Le kit combine les avantages d′un système à base de silice et d′un format Microspin, et permet de s′affranchir des gradients au chlorure de césium, de la précipitation aux alcools et des composés organiques dangereux tels que le phénol et le chloroforme. Les cellules et les tissus sont lysés et homogénéisés dans un tampon contenant du thiocyanate de guanidine,
pour une dénaturation complète des macromolécules et l′inactivation des RNases. L′ajout d′éthanol provoque la fixation de l′ARN lors de la centrifugation du lysat sur une membrane de silice dans un tube de microcentrifugation. Après lavage pour éliminer les contaminants, l′ARN est élué dans 50 à 100 μl de solution d′élution. Il est possible d′isoler jusqu′à 150 μg d′ARN total en moins de 30 minutes.

Si toutes les traces d′ADN contaminant doivent être éliminées, il est recommandé d′effectuer un traitement complémentaire avec de la DNase I. La digestion par la DNase I peut être réalisée lorsque l′ARN est retenu sur la colonne de fixation GenElute à l′aide du Set de digestion sur colonne à la DNase I (DNASE10 et DNASE70). Sinon, pour une élimination plus rigoureuse de l′ADN contaminant, il est possible de traiter la préparation d'ARN finale avec de la DNase I de qualité « amplification » (AMPD1).

Nous nous engageons à vous proposer des alternatives plus respectueuses de l′environnement, respectant au moins l′un des 12 principes pour une chimie plus verte. La chimie mise en œuvre dans ce produit est intrinsèquement plus sûre, comparativement au phénol et au chloroforme normalement employés dans les extractions d′ADN.

Le Kit de purification pour ARN total de mammifère GenElute^™ associe la technologie d′une membrane de silice et le format d'une colonne de centrifugation pour obtenir une méthode de fixation, de lavage et d′élution rapide, permettant de préparer de l′ARN total de grande qualité.

Pour plus d′informations, veuillez consulter le site www.sigma-aldrich.com/extract-n-amp.

GenElute is a trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC