低分子HPLC

低分子
化合物のHPLC

低分子化合物のHPLC分析は、ほとんどの場合、逆相分離モードで行われます。極性化合物の分離には、親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）や正相クロマトグラフィーも適していますが、HILICが好ましい方法です。イオン性化合物の分離にはイオン交換分離モードが、無機陰イオンや陽イオンの分離にはイオンクロマトグラフィーも使用できます。

HPLCカラムは、完全多孔質シリカ粒子、表面多孔質シリカ粒子、高分子粒子で充填されているか、あるいはモノリシックシリカロッドを固定相として構成されている。さらに、アルミナ、ジルコニア粒子、およびカーボン粒子も使用される。低分子の分離における固定相材料の代表的な細孔径は、60 Å～160 Åの範囲にある。 HPLCの場合、固定相の粒子径は通常3 µm～5 µmの範囲ですが、UHPLCではより小さな粒子径、通常は2 µm以下が使用されます。固定相には、さまざまな選択性（修飾）を付与することができます。C18アルキル鎖は、逆相（RP）クロマトグラフィーにおいて最も一般的に使用されるカラム化学修飾です。 それにもかかわらず、C30、C8、フェニル、ペンタフルオロフェニルなどの他の修飾、および幅広い極性の高い修飾に加え、イオン交換性やキラル性を有する修飾を用いることで、液体に溶解するほぼすべての化合物の分離が可能となる。RP-HPLCの移動相は、通常、水性緩衝液、あるいは水とアセトニトリルやメタノールなどの水と混和可能な有機溶媒から構成される。

HPLCの試料前処理

食品、飲料、化粧品、生体試料、およびマトリックスが豊富な医薬品製剤（例：クリーム、シロップ）などの複雑でマトリックスが豊富な試料については、不要な成分を除去し、対象となる分析物を選択的に抽出するための効率的な試料前処理プロトコルが必要となります。これは、2 µm以下の粒子径が使用されるUHPLCのように、粒子径が非常に小さい固定相を用いる場合において極めて重要です。 一般的な試料前処理法としては、液液抽出、固相抽出（SPE）があり、生物試料の場合はろ過に加え、タンパク質の沈殿処理も行われる。 標的化合物の選択的溶出や前濃縮に加え、試料前処理の主な目的は、試料マトリックスによるHPLC固定相の目詰まりを防ぐことにある。モノリシックシリカを基材とするHPLCカラムは、マトリックスに対して高い耐性を示し、粒子状カラムに比べてはるかに少ない試料前処理で済む。 

誘導体化

一部の分子については、HPLC分離の前（プレカラム）または後（ポストカラム）のいずれかで誘導体化が必要となる。誘導体化は、HPLCにおける感度やクロマトグラフィー保持性を向上させるために、分子をその誘導体に変換するものである。必要な誘導体化には、望ましい物理的・化学的特性を持つ化学試薬が使用される。