抗N3ホスホヒスチジン（3-pHis）抗体、クローンSC56-2

リン酸化は、細胞のタンパク質活性およびさまざまな細胞シグナリングイベントの制御において重要な役割を担っています。ホスホヒスチジン（pHis）の検出に利用できるツールには限りがあるため、ほとんどの研究はセリン、トレオニンおよびチロシンのリン酸化が中心となっています。ヒスチジンのリン酸化は、イミダゾール環のN1（1-pHis）およびN3（3-pHis）で生じます。1-pHisおよび3-pHisの安定ホスホリルトリアゾリルアラニンアナログ（1-pTzaおよび3-pTza）を有するペプチドの開発によって、シグナリングイベントにおけるヒスチジンN1およびN3のリン酸化を研究するための抗体の産生が可能となっています。がんおよび腫瘍転移におけるHisキナーゼに関連するエビデンスは増加しており、最初に同定された転移抑制遺伝子は、2つの既知の哺乳類Hisキナーゼのうちの1つNm23-H1（別名：NME1、ヌクレオシド二リン酸キナーゼまたはNDPK-A）です。Nm23-H1/NME1および極めて類縁のNm23-H2（NME2/NDPK-B）は、1-pHis酵素中間体を介して、ATPからヌクレオシド二リン酸（NDP）へのリン酸の転移を触媒します。Nm23-H1/-H2は、Hisキナーゼ活性も有し、活性部位のpHisから標的タンパク質のHisにリン酸を転移します。ホスホグリセリン酸ムターゼ（PGAM）、スクシニルCoA合成酵素（SCS）およびATPクエン酸リアーゼ（ACL）といった代謝酵素も、酵素中間体としてpHisを使用します。NME1/2とは異なり、PGAMは、酵素中間体として3-pHisを使用します。真核生物だけでなく、化学走性に関与する細菌の“2成分の”シグナル伝達経路でもヒスチジンのリン酸化がよく知られていますが、リン酸は受容体／センサータンパク質で形成されたpHisから受容体反応制御タンパク質のAsp残基に転移し、受容体／センサータンパク質は実質的にアスパラギン酸キナーゼとして機能します。

ヒスチジンリン酸化タンパク質に応じて異なります。

ドットブロット解析：3-pTzaホスホヒスチジン類似体を有するペプチドは検出しますが、リン酸化チロシンのみを含むペプチドは検出しません。クローンSC56-2は、NM23-H1/NME1 3-pHis118およびPGAM 3-pHis11の配列に基づく3-pTzaペプチドに対して最も反応性が高く、ACLY 3-pHis760、ヒストンH4 3-pHis18、またはKca3.1 3-pHis358配列に基づく3-pTzaペプチドに対する反応性はそれより低くなっており、GNB1 3-pHis266ベースの3-pTzaペプチドに対する反応性が最も低くなっています（Fuhs, S.R., et al. (2015)。Cell. 162(1):198-210）。

ウェスタンブロッティング：クローンSC56-2ハイブリドーマ培養上清は、形質転換E.Coli 由来ライセートにおいて外因的に発現させたヒトPGAM GST融合タンパク質の熱感受性ヒスチジンN3-リン酸化（3-pHis）のウェスタンブロッティングに使用しました（Fuhs, S.R., et al. (2015)。Cell. 162(1):198-210）。

注記：phosphohistidine検出前にサンプルを加熱しないこと。ヒスチジンリン酸化は、熱や酸に不安定です。特異性試験用のネガティブコントロールを作るため、サンプルの一部を95ºCで10～15分間加熱してヒスチジンリン酸化を元に戻すことができます。別の方法として、サンプルの一部を酸性pH下で、37ºCで15分間インキュベーションして、ヒスチジンリン酸化を還元することもできます。インキュベーション前に、各100 µLのサンプルを25 µLの1 M HClと共に酸性化した後、phosphohistidine検出前に25 µLの1 M NaOHで中和します。

抗N3-ホスホヒスチジン（3-pHis）抗体、クローンSC56-2は異性体特異的モノクローナルAbで、N3の位置でリン酸化されたヒスチジンを特異的に検出します。この精製mAbは、ウェスタンブロッティングとドットブロットにおける性能を実証した発表済みデータにより裏付けされています。

イミダゾール環のN3がリン酸化されたヒスチジン（3-pHis）を有するタンパク質を選択的に検出しますが、1-pHisは検出しません。

標的となる修飾は、種特異的ではありません。

フォーマット：精製

PGAMが触媒する2,3-DPG分解反応のウェスタンブロッティングにより評価されています。

ウェスタンブロッティング：0.52 µg/mLで使用、PGAMが触媒する2,3-diphosphoglycerate（2,3-DPG）分解反応のアリコート5 µg中でN3-phosphohistidine（3-pHis）を有するリコンビナントヒトphosphoglycerate mutase（PGAM）を検出できます。

濃度：ロットに固有のデータシートを参照してください。