혈구계수기를 이용한 세포 계수

세포주를 이용한 대부분의 조작(예: 형질 도입, 세포 융합 기술, 냉동 보존 및 재배양 작업)에서는 사용 전 세포 수를 정량화해야 합니다. 일정한 수의 세포를 사용하면 최적의 성장을 유지할 수 있을 뿐만 아니라 세포 배양을 이용한 절차를 표준화하는 데도 도움이 됩니다. 이는 결과적으로 재현성이 더 우수한 결과를 제공합니다.

섹션 개요

• 재료
• 장비
• 절차
• 핵심 포인트
• 관련 제품

재료

• 세포 배양 배지: 적절한 온도로 예열 (올바른 배지 및 온도는 ECACC 세포주 데이터 시트를 참조하십시오.)
• 멸균수(793213)에 70%(v/v) 알코올
• 트립판 블루 용액 (T8154)
• Ca2+/Mg2+ 미포함 HBSS 내 0.05% 트립신/EDTA (T3924)

장비

• 개인 보호 장비 (멸균 장갑, 실험실 가운, 안전 보호대)
• 적정 온도로 설정된 수조
• 적절한 격리 수준의 미생물 안전 캐비닛
• 원심 분리기
• _{이산화탄소} 인큐베이터
• 혈구 계수기
• 역상 현미경
• 사전 라벨링된 플라스크

절차

1. 이전에 설명한 바와 같이 트립신/EDTA를 사용하여 부착 및 반부착 세포를 현탁액으로 만든 다음, 트립신 양과 최소한 동등한 양의 신선한 배지에 재현탁합니다. 덩어리로 성장하는 세포의 경우 원심 분리하고 소량의 용액에 재현탁한 다음 부드럽게 피펫팅하여 덩어리를 분해합니다.
2. 무균 조건에서 세포 현탁액 100-200 μL를 취한다.
3. 동일한 양의 트리판 블루(희석 배율 =2)를 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
4. 혈구 계수기를 세척합니다.
5. 물 또는 숨을 내쉬어 커버슬립을 적신다. 커버슬립을 약간의 압력을 가하며 챔버 위에서 앞뒤로 미끄러뜨려 뉴턴 굴절 고리가 나타날 때까지 한다(뉴턴 굴절 고리는 커버슬립 아래 무지개 같은 고리로 보인다).
6. 챔버 양쪽에 세포 현탁액(약 5-10 μL)을 채우고, 역상 위상차 현미경에서 20배율로 관찰합니다.
7. 생존 세포(밝게 보이는 세포)와 비생존 세포(푸른색으로 염색된 세포)의 수를 세십시오. 세포 계수 정확도를 높이기 위해 이상적으로 100개 이상의 세포를 계수해야 합니다(아래 참고 사항 참조). 100개 이상 계수한 사각형의 수를 기록하십시오.
8. 아래 방정식을 사용하여 생존 세포 및 비생존 세포의 농도와 생존 세포의 백분율을 계산하십시오.

주요 사항

1. 트라이판 블루는 독성이 있으며 발암 가능성이 있습니다. 보호복, 장갑 및 안면/눈 보호 장비를 착용해야 합니다. 증기를 흡입하지 마십시오.
2. 계수실의 중심 영역은1 mm²입니다. 이 영역은 25개의 작은 사각형(1/25mm²)으로 세분화됩니다. 각 사각형은 삼중 선으로 둘러싸여 있으며, 다시 16개(1/400mm²)로 나뉩니다. 계수실의 깊이는 0.1 mm입니다.
3. 보정 계수104는 0.1mm³를 1 mL로 변환합니다(0.1mm³ = 1mm² × 0.1 mm).
4. 오차 발생 원인은 다음과 같습니다:

• 챔버 내 공기 방울 및 잔해물의 존재
• 샘플이 채널이나 다른 챔버로 넘쳐흐를 정도로 챔버를 과도하게 채움
• 챔버의 불완전한 채움 챔버 전체에 걸쳐 세포가 고르게 분포되지 않음
• 계수할 세포 수가 너무 적음. 세포를 원심분리한 후 더 적은 부피로 재현탁하여 재계수하면 해결 가능
• 셀 수가 너무 많아 계수가 어려운 경우. 트리판 블루에서 더 높은 희석 비율(예: 1:10)을 사용하면 해결 가능

1. 혈구계수기 사용은 시간이 많이 소요될 수 있으며 조작자의 주관적 판단에 취약합니다. 군집을 형성하는 세포와 같은 일부 세포 유형은 이 방법으로 계수하기가 특히 어렵습니다. 대체 세포 정량 방법을 제공하는 세포 계수 장비가 있습니다. Millicell^® DCI 디지털 세포 이미저를 사용하면 혈구계수기에서 또는 세포 배양 플라스크, 플레이트, 접시 및 기타 용기에서 직접 세포 수를 추정할 수 있습니다. 이를 통해 세포 배양 매개변수를 보다 객관적으로 결정할 수 있으며 사용자 오류 위험을 줄일 수 있습니다. Scepter^™ 3.0 세포 카운터는 휴대용 핸드헬드 세포 계수기로, 컬터 원리를 이용해 부피를 측정합니다. 이 장비는 크기 기반 세포 계수가 가능하며, 물체 인식 소프트웨어에 의존하여 작은 세포를 안정적으로 감지하지 못하는 비전 기반 기술과 달리 큰 세포와 작은 잔해물을 구분합니다. Scepter^™ 3.0 세포 계수기는 모든 세포를 감지하여 세포 크기 분포 히스토그램으로 집단을 표시합니다. 히스토그램에서 모든 세포를 계수하거나 게이트 기능을 사용하여 선택한 하위 집단을 계수할 수 있습니다. 히스토그램의 변화를 모니터링함으로써 실험 간 세포 배양의 건강 상태와 품질에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.