KAPA 익스프레스 추출 키트 자주 묻는 질문

• 신속 추출 프로토콜: 15분 만에 PCR 사용 가능한 DNA
• 범용성: 다양한 시료 유형에 최적화된 단일 키트
• 단일 튜브 반응으로 오염 위험 최소화
• KAPA2G Robust HotStart ReadyMix와 함께 사용하면 PCR 성공률 향상

시료 유형에 따라 단일 추출로 일반적으로 50~500회의 표준 PCR 반응에 충분한 템플릿 DNA를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 추출된 상층액 1~2μL를 PCR 반응(50~100회 PCR)에 사용합니다. 단일 추출로 수행 가능한 PCR 반응 횟수를 확인하려면, 소량의 추출 시료를 TE 또는 Tris pH 8.0으로 연속 희석하십시오. 각 연속 희석액으로 PCR을 수행하여 최적의 희석 배율을 결정하십시오.

• 인간 조직 (포매 고정 알코올 처리 조직(FFPE) 샘플, EDTA 튜브 또는 채혈 카드에 채취된 혈액, 구강 내막 면봉, 모낭, 법의학적 샘플)
• 동물 샘플(귀 또는 꼬리 절편, 모낭, 혈액, 골수, 마우스 및 기타 포유류의 건조 또는 신선한 고기)
• 어류 조직 (지느러미 펀치, 신선 조직, 냉연 및 열연 훈제 통조림 샘플, 에탄올 보존 샘플)
• 곤충 (분쇄된)
• 조류 깃털 (깃털 조각)

• 식물 샘플
• 분해된 샘플
• 장기간 보관된 시료
• 품질 불명의 시료

KAPA Express 추출 키트는 다양한 시료 유형에서 DNA를 추출하기 위해 광범위하게 테스트되었습니다. 시료 유형에 따라 추출 과정과 후속 PCR 모두에 영향을 미칠 수 있는 다양한 DNA 손상 물질 및/또는 억제제가 존재할 가능성이 있습니다. 먼저 다음 권장 사항을 사용하여 PCR 프로토콜을 최적화한 후 DNA 추출을 반복하십시오.

PCR 최적화

• KAPA Express Extract를 사용한 다운스트림 PCR에는 KAPA2G Robust HotStart ReadyMix 또는 KAPA2G Robust DNA Polymerase 키트를 권장합니다. KAPA2G Robust DNA Polymerase는 향상된 진행성과 일반적인 PCR 억제제에 대한 내성을 위해 특별히 설계되었습니다. KAPA2G Robust DNA Polymerase의 견고성은 KAPA Express Extract를 사용한 원시 추출 응용 분야에서 PCR 성공률을 높이는 데 특히 유용합니다.
• 일부 원유 DNA 추출물에는 고농도의 PCR 억제제가 포함될 수 있습니다. KAPA2G Robust DNA Polymerase 사용 시 만족스러운 결과를 얻지 못할 경우, PCR 전 DNA 추출물을 희석해야 할 수 있습니다. 양성 대조군 샘플(예: 컬럼 기반 키트로 정제한 게놈 DNA)과 DNA 추출물의 10배 희석 시리즈(TE 또는 10 mM Tris-HCl, pH 8.0–8.5로 준비)를 사용하여 실험을 반복하십시오. DNA 추출물에 알려진 농도의 양성 대조군 샘플을 "스파이크"하여 억제제가 희석될 수 있는지 확인하는 동시에 표적 증폭을 지원할 만큼 충분히 높은 템플릿 농도를 유지할 수 있는지 평가하십시오.
• 애닐링 온도를 2°C~5°C 낮추거나, 애닐링 또는 연장 시간을 늘리십시오.
• 시료 내 억제제 존재로 인한 RNA 또는 분해된 DNA로 인해 비특이적 산물, 프라이머 다이머 및/또는 스미어링이 발생할 수 있습니다. PCR 사이클링 프로토콜 수정(예: 어닐링 온도 증가, 어닐링 및/또는 연장 시간 감소) 및 HotStart DNA 중합효소 사용은 비특이적 증폭을 줄일 수 있습니다.
• 추출이 어려운 시료 유형에서 추출한 DNA는 억제제를 제거하기 위해 이소프로판올 또는 에탄올 침전을 사용하여 추가 정제할 수 있습니다.

DNA 추출 최적화

• 75°C에서의 용해 단계는 10분에서 30분 사이로 조절할 수 있습니다. DNA 수율을 극대화하려면 75°C에서 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하십시오(예: 쥐 및 개 조직은 15~20분 인큐베이션이 필요합니다).
• 특정 시료 유형(예: 어류)의 경우 용해 단계 온도를 75°C에서 60°C로 낮추면 추출 효율이 향상됩니다. 용해 온도는 55°C~75°C에서 10분간 온도 구배를 수행한 후 95°C에서 5분간 인큐베이션하여 최적화할 수 있습니다.
• KAPA Express 추출 효소는 95°C에서 최소 5분간 열 불활성화하는 것이 필수적입니다. 잔류 효소는 PCR 과정에서 DNA 중합효소를 분해할 수 있기 때문입니다.
• 특정 시료 유형을 첨가하면 pH가 7 미만으로 낮아질 수 있습니다. DNA는 낮은 pH 환경, 특히 용해 프로토콜 중 고온에서 빠르게 분해됩니다. 용해 프로토콜 완료 후 추출된 DNA의 pH를 pH 종이로 측정하십시오. pH가 7.5 미만일 경우 최종 농도 1.5~2X의 KAPA Express Extract Buffer를 사용하십시오. 또는 초기 추출 반응에 더 적은 양의 시료를 첨가할 수 있습니다.
• 일반적으로 DNA 추출물은 PCR 사용 전 정량할 필요가 없으며, 정량을 권장하지 않습니다. 다만 NanoDrop 또는 동등한 장비를 사용하여 오염 인자의 양을 대략적으로 파악하는 것은 가능합니다.

추출 반응 후 원심분리 단계를 생략할 수 있으나, 이는 시료 유형에 따라 다릅니다. KAPA2G Robust DNA Polymerase는 하류 PCR에 권장됩니다. 이는 시료 잔여물과 억제제가 더 높은 농도로 존재하며, 야생형 Taq와 같은 다른 DNA 중합효소를 사용할 경우 거의 항상 신뢰할 수 없는 결과를 초래하기 때문입니다. 잔여물을 침전시키면 더 신뢰할 수 있는 PCR 결과를 얻을 수 있습니다. 하류 응용 전에 혈액을 반드시 침전시켜야 합니다.

KAPA Express Extract 키트로 추출한 DNA는 qPCR에 직접 사용할 수 있으나 제한 사항이 존재합니다. 주요 제한 사항은 다음과 같습니다: 이염기 억제제(예: 혈액)에 의한 형광체 소멸은 SYBR® 형광을 소멸시키는 것으로 잘 알려져 있으며, qPCR 반응 억제 및/또는 추출 프로토콜로 인한 낮은 DNA 농도가 포함됩니다.

KAPA Express Extract를 하류 qPCR에 사용할 때의 권장 사항은 다음과 같습니다:

• 추출된 DNA를 TE 또는 10 mM Tris pH 8.0으로 연속 희석하십시오. 이는 잠재적 억제제를 희석하여 PCR 억제 및 형광체 소멸을 줄일 수 있습니다. 일부 소멸은 남아 있을 수 있으며, DNA 농도가 과소평가될 가능성이 있습니다.
• 형광체의 소멸은 사용된 유형에 따라 다르므로 다른 형광체를 사용해 보십시오. KAPA SYBR DNA Polymerase는 엄격한 실시간 qPCR 반응 조건에서 최적의 성능을 발휘하도록 설계되었으며, SYBR Green I 염료에 대한 억제 효과가 감소되어 SYBR Green I 농도를 높여 사용할 수 있습니다.
• DNA 추출물에 알려진 농도의 양성 대조군 샘플을 "스파이크"하여 억제제가 희석될 수 있는지 확인해 볼 수도 있습니다. 이상적으로는 KAPA Express Extract 샘플로부터 연속 희석액을 준비하고, 표준 곡선에서 한 농도로 사용된 동일한 DNA를 모든 연속 희석액에 첨가합니다. 이를 통해 억제제(연속 희석액 전반에 걸쳐 점차 지연되는 Ct 점수) 또는 추출된 샘플에 DNA가 없는 경우(희석하지 않은 샘플에서도 표준과 동일한 Ct 점수)를 명확하게 판단할 수 있습니다.
• DNA 수율을 극대화하기 위해 다양한 용해 프로토콜을 시도하십시오(권장 사항은 상기 참조).

수령 즉시 전체 키트를 -20°C의 항온 냉동고에 보관하십시오. 이러한 조건에서 보관하고 올바르게 취급할 경우, 모든 키트 구성품은 수령일로부터 최소 6개월 동안 또는 키트에 표시된 유효 기간까지 완전한 활성을 유지합니다. KAPA Express 추출 완충액 및 효소는 정기적이고 단기적인 사용(최대 1주일)을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다. 신중하게 취급되고 오염되지 않은 경우, 키트 구성품은 실온에서 (의도치 않게) 단기간(최대 24시간) 방치되어도 문제가 발생하지 않을 것으로 예상됩니다. 실온 또는 4°C에서의 장기 보관은 권장하지 않습니다. -20°C 이상에서 보관된 시약은 사용자에 의한 오염 시 분해되기 쉬우므로, 해당 온도에서의 보관은 사용자의 책임 하에 이루어져야 함을 유의하십시오.

KAPA Express Extract Kit를 사용하여 추출한 DNA는 1X Express Extract Buffer에서 시간이 지남에 따라 분해되며, 잔류 억제제의 존재는 분해 과정을 가속화할 수 있습니다. 일반적으로 구강 면봉이나 모낭과 같은 "깨끗한" 시료에서 추출한 DNA는 추출 후 4°C 또는 -20°C에서 수 주간 안정적이지만, 시료 유형에 따라 이 기간은 수일로 단축될 수 있습니다. 장기 보관을 위해서는 DNA 추출물을 TE Buffer로 1:5 희석하는 것이 권장됩니다. 이는 DNA가 안정적인 완충 환경에서 보관되도록 하기 위함입니다. 희석 비율은 하류 응용 분야와 DNA 수율에 따라 1:1에서 1:20 사이로 조정할 수 있습니다. EDTA에 민감한 하류 응용의 경우, TE를 pH 8.0–8.5의 10 mM Tris-HCl로 대체할 수 있습니다. 이 방식으로 보관된 DNA 추출물은 일반적으로 최소 6개월 동안 안정적입니다. 장기 보관(특히 잔류 억제제 농도가 높은 시료의 경우)을 위해서는 억제제를 완전히 제거하기 위해 이소프로판올 또는 에탄올 침전을 이용한 추가 정제를 권장합니다.

야생형 Taq 중합효소는 "깨끗한" 시료 유형(예: 구강 면봉, 모낭)에서 추출한 DNA와 함께 작동하지만, 더 까다로운 시료 및 템플릿을 증폭할 때는 신뢰할 수 없습니다. 최고의 성능 증폭을 위해서는 모든 시료 유형에 KAPA2G Robust HotStart ReadyMix 사용을 권장합니다.

KAPA Taq DNA 중합효소, KAPA2G Fast DNA 중합효소, KAPA HiFi DNA 중합효소 및 KAPA SYBR FAST qPCR 키트는 모두 KAPA Express Extract로 추출한 DNA를 사용하여 다양한 증폭 산물을 성공적으로 증폭하는 데 사용되었습니다. KAPA2G Robust DNA 중합효소는 잔류 억제제가 존재하는 환경에서 향상된 성능을 보이기 때문에 KAPA Express Extract로 추출한 DNA를 일상적으로 사용할 때 권장됩니다.

KAPA Express 추출 키트를 사용할 때는 크실렌 세척 단계가 필요하지 않습니다. 원심 분리 단계 후, 왁스 층은 일반적으로 완충액 상단이나 측면에 위치합니다. 상층액에는 DNA가 포함되어 있으며, 상부의 왁스층을 뚫어 회수합니다. 샘플 주변의 과도한 왁스는 멸균 메스로 잘라내어 조직만 남기는 것이 좋습니다. 과도한 왁스는 추출 과정에 영향을 주지 않지만, DNA 회수를 어렵게 할 수 있습니다.

추출 공정은 DNA에 최적화되어 있습니다. RNA는 가열 프로토콜 동안 화학적으로 분해되며, KAPA Express Extract Kit를 사용한 RNA 추출은 권장되지 않습니다.