KAPA3G 식물 PCR 키트 자주 묻는 질문

반응 설정

• 시작 템플릿 양: 고품질 DNA의 경우, 대부분의 응용 분야에서는 50 µL 반응당 1–10 ng의 게놈 DNA가 충분합니다. 거친 샘플, 억제제로 오염된 DNA 및 저품질 DNA의 경우, 템플릿 희석 시리즈 PCR을 통해 반응당 최적의 템플릿 농도를 결정하는 것이 필수적입니다.
• 직접 PCR용 시료량: 대부분의 응용 분야에서는 직경 0.5 mm의 채취 도구를 사용하는 것이 권장되나, 문제가 있는 종/시료의 경우 직경 0.35 mm 채취 도구를 사용하면 더 높은 품질의 결과를 얻을 수 있습니다. 정제된 DNA와 함께 원시 시료를 PCR 반응에 첨가하면 시료의 억제 정도와 반응 내 원시 시료량을 줄여야 할지 여부를 판단할 수 있습니다.
• 원시 PCR용 시료량: 기술 데이터 시트 및 KAPA3G 식물 PCR 응용 노트의 지침에 따라 원시 잎 또는 종자 준비물 1 µL.
• 효소 양: 대부분의 응용 분야에는 50 µL 반응당 KAPA3G 식물 DNA 중합효소 1단위(반응량이 더 적을 경우 비례적으로 감소)가 적합합니다. 1 U/50 µL 반응으로 실패하는 까다로운 원시 시료의 PCR의 경우 효소 양을 증가시킵니다. 반대로, 비특이적 증폭 및/또는 스미어링이 발생할 경우 효소 양을 줄여 결과를 개선할 수 있습니다.
• 프라이머 농도: 최종 반응액 내 각 프라이머 농도는 0.3 µM입니다. 비특이적 증폭산물이나 고분자량 스미어가 관찰될 경우 프라이머 농도를 낮출 수 있으나, 최종 농도는 0.1 µM 이하로 떨어지지 않도록 합니다.
• 마그네슘 농도: KAPA3G 식물 PCR 키트는 정제된 DNA에 충분한 1X 농도 1.5 mM의 MgCl2를 포함한 2X 버퍼와 함께 제공됩니다. 일반적으로 원시 시료의 경우 최종 MgCl₂ 농도 2.0 mM을 권장합니다. 드물게 최종 MgCl₂ 농도 >1.5 mM에서 스미어 현상이 발생할 수 있으며, 이 경우 MgCl₂ 농도를 낮추십시오. 추가 MgCl₂(25 mM)가 모든 키트에 포함되어 있어 추가 MgCl₂가 필요한 분석이나 최종 MgCl₂ 농도 최적화에 활용할 수 있습니다.
• 게놈 표적 길이: KAPA3G 식물 PCR 키트를 사용하여 정제된 DNA로부터 7kb를 초과하는 단편을 성공적으로 증폭한 사례가 있습니다. 그러나 긴 단편의 성공 여부는 템플릿 품질과 프라이머 및 템플릿 특성에 크게 좌우됩니다.
• 원료 시료 사용 시 반응 용량: 초기 접근법으로 50 µL 반응당 KAPA3G 식물 DNA 중합효소 1 U(0.4 µL)를 사용하십시오. 많은 원료 시료 유형은 더 작은 반응 용량(1 U 효소/50 µL에 상응하는 양, 예: 25 µL 반응에 0.5 U 효소)에서도 작동합니다. 최상의 결과를 위해 일반적으로 50 µL 반응이 필요한 종은 포도나무, 담배 및 알려진 높은 폴리페놀 함량을 가진 기타 종들입니다. 50 µL 미만의 반응 용량에서도 잘 작동하는 종에는 쌀과 옥수수가 포함됩니다. 그러나 반응 용량을 축소할 때의 PCR 효율은 항상 경험적으로 확인해야 합니다.

사이클링 매개변수

• 변성 시간: 원시 시료의 경우 초기 변성 시간을 최소 10분 이상 권장합니다. 특히 반응이 어려운 템플릿의 경우 초기 변성 시간을 20분까지 늘리면 결과가 개선될 수 있습니다.
• 연장 시간: 초기 접근법으로 30초/kb를 사용하십시오. 원하는 산물보다 긴 비특이적 산물이 관찰될 경우 연장 시간을 20~25초/kb로 줄이십시오. 연장 시간이 너무 길면 비특이적 증폭이나 스미어링이 발생할 수 있으며, 너무 짧으면 낮은 수율을 초래할 수 있습니다.
• 애닐링 온도: 최적 애닐링 온도는 프라이머 및 템플릿 특성뿐만 아니라 화학적 환경(버퍼, 첨가제 및 시료 구성)에 의해 결정됩니다. 초기 접근법으로 평균 프라이머 Tm + 2°C로 시작하십시오. 결과가 만족스럽지 않을 경우 정제된 DNA로 애닐링 온도 그라데이션 PCR을 수행하여 특정 산물의 최고 수율을 생성하는 애닐링 온도를 결정하십시오.
• 애닐링 시간: 초기 접근법으로 15초를 사용하십시오. 비특이적 증폭이 관찰되면 애닐링 시간을 10초로 줄이거나, 수율을 높이기 위해 최대 30초까지 늘리십시오. 일반적으로 15초의 애닐링 시간은 다양한 반응 용량, 열순환기, 그리고 대다수의 프라이머 세트에 효과적입니다. 다른 최적화 시도가 실패한 경우에만 애닐링 시간을 수정하십시오.
• PCR 사이클: 초기 접근법으로 40사이클을 사용한 후, 얻어진 결과에 따라 사이클 수를 증감하십시오. 원시 시료에서의 성공적인 PCR은 일반적으로 40~50사이클이 필요합니다.

• 어닐링 온도를 높이거나 어닐링 온도 구배 PCR에서 최적 어닐링 온도를 결정하십시오.
• MgCl₂ 농도를 최적화하십시오.
• 사이클 수를 줄이십시오.
• 증폭 산물이 1kb 이하인 경우 사이클당 연장 시간을 15초/kb로, 1~5kb인 경우 사이클당 20~25초/kb로 줄이십시오.
• 반응 내 템플릿 양을 줄이십시오. 고품질 DNA의 경우, 대부분의 응용 분야에 50 µL 반응당 1 – 10 ng의 게놈 DNA가 충분합니다.
• 프라이머 농도를 줄이되, 각 프라이머의 농도는 0.1 µM 미만으로 하지 마십시오.
• 애닐링 시간을 10초/사이클로 줄이십시오.
• 반응당 효소 양을 줄이십시오.
• 프라이머 간 또는 프라이머 내 상호작용을 제거하거나 특이성을 개선하기 위해 프라이머를 재설계하십시오.

대부분의 PCR 분석에는 30초/kb의 연장이 시간이 적합하며, 비특이적 증폭을 줄여야 할 경우 20~25초/kb로 단축할 수 있습니다.

대부분의 응용 분야에서는 50 µL 반응당 KAPA3G 식물 DNA 중합효소 1단위(또는 더 적은 반응 용량에 비례하여 더 적은 양)가 적합합니다. 그러나 다음과 같은 경우에는 효소 양을 늘리거나 줄이면 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다:

• 1 U/50 µL 반응에서 작동하지 않는 까다로운 원료 샘플로부터 PCR을 수행할 경우, 효소 양을 증가시키십시오.
• 다음과 같은 경우 반응당 효소량을 줄이면 결과가 개선될 수 있습니다:
  • 특히 긴 단편 증폭 시 번짐 현상이 발생하는 경우
  • 비특이적 증폭 산물의 높은 배경 신호가 관찰될 때

애닐링 온도, 사이클 수 및 마그네슘 농도가 가능한 원인에서 배제된 후에만 효소 농도를 최적화하십시오.

KAPA3G 식물 PCR 키트는 1X 농도 1.5 mM의 MgCl₂를 포함한 2X 버퍼와 함께 제공됩니다. 추가 MgCl₂(25 mM)가 모든 키트에 포함되어 있어 추가 MgCl₂가 필요한 분석이나 최종 MgCl₂ 농도 최적화를 위한 용도로 사용할 수 있습니다.

• 특정 종/시료로부터 템플릿 DNA를 정제하고, 이를 사용하여 기본 PCR 매개변수(시약 농도 및 사이클링 매개변수)를 설정 및 최적화하며 검사의 민감도(검출 가능한 최소 표적 복제수)를 결정한다.
• 실험용 템플릿의 10배 희석 시리즈를 준비하거나, 직경 0.35mm 또는 0.5mm의 원시 샘플 디스크를 사용하십시오. 템플릿 희석 시리즈에 대해 중복 반응을 설정하고, 한 세트에는 알려진 양의 표적(검출 한계보다 10~100배 많은 양)을 첨가하십시오. 원시 시료의 경우, 억제 정도를 평가하기 위해 정제된 템플릿이 첨가된 반응에 원시 시료를 서로 다른 양으로 첨가하여 삼중 반응 세트를 수행하십시오.
• 이러한 희석 시리즈 실험 결과는 실험용 템플릿 내 억제 요소가 표적 증폭 산물의 감도 범위 내에서 희석될 수 있는지 여부와 특정 원시 시료 유형 및/또는 크기로부터 신뢰할 수 있는 증폭이 가능한지를 나타낼 것입니다.

KAPA3G 식물 PCR 키트의 장기 보관 권장 온도는 -20°C입니다. 단, 키트 구성품은 단기 사용(최대 1개월)을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.

KAPA Plant PCR 버퍼는 다양한 반응 조건 및 다양한 템플릿과 증폭산물 유형에서 최적의 효소 성능을 발휘하도록 설계되었습니다. 따라서 대부분의 응용 분야에서는 추가 첨가제가 필요하지 않습니다. 사용자가 첨가제 실험을 원할 경우 다음 전략을 고려할 수 있습니다:

• 반응액에 PVPP, PVP40 또는 PEG 8000 등의 첨가제를 포함시키십시오. PVP40과 PEG 8000은 모두 최종 농도 1~3%(m/v)로 포함시킬 수 있습니다.
• 매우 문제가 되는 비특이적 증폭을 해결하기 위해 최종 농도 2.5%의 글리세롤을 포함시킵니다.
• 최종 DMSO 5%(v/v) 첨가는 고 GC 함량 템플릿의 증폭을 가능하게 합니다. KAPA Plant PCR Buffer는 일반적으로 첨가제 없이도 약 70% GC 함량까지의 표적에서 작동합니다. 글리세롤 및/또는 DMSO 첨가는 저 GC 함량 템플릿의 증폭 실패를 유발할 수 있음에 유의하십시오.
• 체계적인 접근법을 통해 다른 PCR 첨가제를 연구할 수 있습니다. KAPA 3G 식물 DNA 중합효소는 일반적으로 야생형 Taq보다 높은 농도의 첨가제를 허용하지만, 각 첨가제의 상대적 이점과 최적 농도는 경험적으로 결정해야 합니다.

KAPA3G 식물 PCR 키트로 생성된 PCR 산물은 KAPA Long Range로 생성된 PCR 산물과 동일한 특성을 가지며, 제한효소(RE) 처리 및 시퀀싱과 같은 일상적인 다운스트림 응용에 적합합니다. KAPA3G 식물 PCR 키트로 생성된 PCR 산물은 3'-dA 꼬리 구조를 가지며, TA 클로닝에 사용하거나 클로닝 전에 평단말 처리하거나 제한효소로 처리할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 표준 컬럼 또는 비드 기반 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하는 것이 권장됩니다.

KAPA3G 식물 PCR 키트는 다중 PCR에 사용할 수 있으나, 반응 조건의 최적화가 필요할 수 있습니다.

직접 및 원시 시료 PCR은 까다로운 응용 분야이며, 어떤 원시 시료 유형에서 어떤 증폭 산물이 성공적으로 증폭될지 예측하기 어렵습니다. 아래 제시된 프로토콜은 KAPA 3G 식물 PCR 키트를 사용한 원시 템플릿 준비 및 원시 시료 PCR의 시작점입니다:

• 잎 샘플 또는 여과지에 도포된 식물 수액 샘플의 경우, 직경 0.5mm의 Harris Uni-Core™ 또는 유사한 채취 도구를 사용하여 PCR 반응에 직접 첨가할 수 있는 원반을 얻으십시오. 원시 샘플이 유발하는 억제 정도를 파악하기 위해 정제된 DNA가 알려진 양으로 포함된 반응에도 원시 샘플을 첨가하는 것을 잊지 마십시오. 이 "스파이크된" 반응에서 증폭이 발생하지 않으면 시료의 억제 효과가 매우 강하므로, 원시 시료의 크기를 더욱 줄이거나 희석 프로토콜을 따라야 합니다. 직경 0.35mm의 Harris Uni-Cor 샘플링 도구도 제공되며, 극도로 억제 효과가 강한 시료에 유용할 수 있습니다. 포도나무 잎과 같이 구조가 훨씬 단단하고 작업하기 쉬운 일부 샘플 유형은 이러한 작은 직경의 채취 도구에 더 적합합니다. 재료의 매우 강한 억제 특성으로 인해 0.35mm 직경의 포도나무 잎 원반이 0.5mm 원반보다 더 나은 결과를 제공할 수도 있습니다.
• 식물 펀치 대신, 그리고 한 번의 준비로 여러 PCR을 수행할 수 있도록, 사용자 가이드 및 KAPA3G 식물 PCR 응용 노트에 설명된 추출 버퍼를 사용할 수도 있습니다.
• PCR용 잎 시료는 채취 후 가능한 한 빨리 처리하십시오. 동결-해동된 식물 재료의 경우 특히 신속하게 PCR을 설정하고 즉시 사이클링을 시작하는 것이 중요합니다.
• 반응에 원시 재료를 직접 사용하거나 추출 버퍼를 사용한 준비물로 증폭이 이루어지지 않을 경우, 추출물을 희석해 보십시오. 추출물 희석으로도 효과가 없다면, 해당 샘플 유형은 원시 샘플 PCR에 적합하지 않거나 DNA가 분해되었을 수 있습니다.
• 종자 재료는 0.5mm 또는 0.35mm 채취 도구를 사용하거나, 추출 완충액을 사용하여 위에서 논의한 것과 유사한 방법으로 채취할 수도 있습니다.

지금까지 이 키트는 아라비도프시스, 콩, 레몬, 옥수수, 쌀, 사탕수수, 담배, 유칼립투스, 자작나무, 쌀, 토마토 등의 건조 잎에서 증폭에 성공적으로 사용되었습니다. 건조 포도나무 잎과 같은 모든 종에서 건조 잎의 직접 증폭이 가능한 것은 아니나, 사용자 가이드 및 KAPA3G 식물 PCR 응용 노트에 설명된 추출 완충액으로 추출한 경우에는 작동할 것입니다. 또한 잎의 노화 정도와 보관 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 옥수수, 대두, 콩, 유채, 밀, 아마씨, 완두 등 건조 종자 재료로부터의 증폭이 성공적으로 이루어졌습니다. 초기 테스트 시에는 반응에 종자 재료를 직접 사용하는 것이 권장되나, 원추출물을 다양한 부피로 템플릿으로 사용한 반응도 병행 실행해야 합니다. 이는 테스트 요구사항에 따라 달라질 수 있습니다—한 종자로 더 많은 테스트가 필요한 경우 추출 완충액 사용이 선호되는 방법일 수 있으며, 일회성 테스트의 경우 직접 PCR이 적합할 수 있습니다.

• KAPA3G 식물 PCR 키트는 CTAB 추출 DNA의 증폭에 매우 효과적입니다.

KAPA3G 식물 PCR 키트는 Extract-N-Amp™ 방법과 같은 상용 "조(粗) 추출" DNA 추출 방법으로 분리된 DNA의 증폭에도 사용할 수 있습니다.