KAPA2G 로버스트 PCR 키트 자주 묻는 질문

KAPA2G Robust PCR 키트는 지시적 진화 과정을 통해 설계된 2세대 효소인 KAPA2G Robust DNA 중합효소를 함유한다는 점에서 독특합니다. KAPA2G Robust DNA 중합효소의 새로운 아미노산 변이는 더 높은 연속성과 특이 활성을 제공하여, AT 및 GC가 풍부한 다양한 증폭산물 전반에 걸쳐 강력한 성능을 발휘합니다. 또한 KAPA2G Robust DNA 중합효소는 야생형 Taq 또는 열안정성 중합효소로 구성된 소위 "강력한" 혼합물과 비교하여 일반적인 PCR 억제제(예: 염류, 요소, SDS 및 에탄올)에 대한 내성이 향상되었습니다.

• 반응 설정
  • 시작 템플릿 양: 고품질 DNA의 경우, 대부분의 응용 분야에서 25 µL 반응당 1–50 ng 게놈 DNA 또는 ≤1 ng 플라스미드/람다 DNA를 사용하십시오. 거친 샘플, 억제제로 오염된 DNA 및 저품질 DNA의 경우, 템플릿 희석 시리즈 PCR을 통해 반응당 최적의 템플릿 농도를 결정하십시오.
  • 템플릿 품질: 분해된 DNA, 낮은 농도의 DNA 및/또는 높은 수준의 PCR 억제제를 포함하는 DNA에서는 표적 증폭 산물의 높은 수율을 기대해서는 안 됩니다.
  • 효소량: 양질의 DNA의 경우 25 µL 반응당 KAPA2G Robust 0.5 U를 사용하십시오. GC 함량이 높은 증폭산물 및 기타 어려운 시료의 경우 25 µL 반응당 효소 1 U를 사용하십시오.
  • 프라이머 및 dNTP 농도: 각 dNTP의 최종 농도는 0.2 mM, 각 프라이머의 최종 농도는 0.5 µM로 사용하십시오.
  • 게놈 표적 길이: KAPA2G Robust를 사용하여 6kb를 초과하는 단편도 성공적으로 증폭되었습니다. 그러나 긴 단편의 성공 여부는 템플릿 품질과 프라이머 및 템플릿 특성에 크게 좌우됩니다. 긴 DNA 단편의 안정적인 증폭을 위해서는 KAPA HiFi DNA Polymerase를 사용하십시오.
• 사이클링 매개변수
  • 연장 시간: 사이클당 15–30초/kb를 사용하십시오. 연장 시간이 너무 길면 비특이적 증폭이나 스미어링이 발생할 수 있으며, 너무 짧으면 낮은 수율을 초래할 수 있습니다.
  • 애닐링 시간: 양질의 DNA의 경우 사이클당 15초를 사용하십시오. 느린 사이클러나 적은 반응량(<25 µL)의 경우 사이클당 10초로 줄일 수 있습니다. 어려운 샘플의 경우 애닐링 시간을 사이클당 30초로 늘릴 수 있습니다.
  • 애닐링 온도: 최적 애닐링 온도는 프라이머 및 템플릿 특성뿐만 아니라 화학적 환경(버퍼, 첨가제 및 시료 구성)에 의해 결정됩니다. 알려진 애닐링 온도로 시작하거나 초기 접근법으로 55°C를 사용하십시오. 애닐링 온도 그라데이션 PCR을 수행하여 특이적 산물의 최고 수율을 생성하는 애닐링 온도를 결정하십시오.

• 애닐링 시간을 사이클당 10~15초로 줄이십시오.
• 애닐링 온도를 높이거나 애닐링 온도 그라데이션 PCR을 통해 최적의 애닐링 온도를 결정하십시오. 일반적으로 55°C 미만의 애닐링 온도는 권장되지 않습니다.
• 증폭 산물이 1kb 이하인 경우 사이클당 연장 시간을 15초/kb로, 1~3.5kb인 경우 사이클당 15~30초/kb로 줄이십시오.
• 반응 내 템플릿 양을 줄이십시오. 고품질 DNA의 경우, 대부분의 응용 분야에서 25 µL 반응당 1–50 ng 게놈 DNA 또는 ≤1 ng 플라스미드/람다 DNA를 사용하십시오.
• 사이클 수를 줄이십시오.
• 반응당 효소 양을 줄이십시오.
• 키트에 포함된 다른 KAPA2G Robust 버퍼를 사용해 보십시오.
• KAPA2G Buffer A 또는 B로 설정된 반응 혼합물에 1x KAPA Enhancer 1을 포함시키십시오.
• MgCl2 농도를 최적화하십시오.
• 반응에 DMSO를 최종 농도 5~10%로 포함시키십시오.
• 프라이머 농도를 낮추되, 각 프라이머의 농도가 0.1 µM 이하로 떨어지지 않도록 하십시오. 낮은 프라이머 농도와 함께 평소보다 낮은 dNTP 농도(각 0.2 mM 미만)를 조합하여 사용하지 마십시오.
• 프라이머 간 또는 프라이머 내 상호작용을 제거하거나 특이성을 개선하기 위해 프라이머를 재설계하십시오.

대부분의 PCR 분석에는 사이클당 15초/kb의 연장이 시간이 적합하며, 고농도의 양질 템플릿을 사용할 경우 사이클당 5~10초/kb로 단축할 수도 있습니다. 그러나 원료 샘플, GC 풍부한 증폭산물 또는 템플릿, 기타 어려운 분석의 경우 사이클당 30초/kb로 연장 시간을 늘릴 수 있습니다. 스미어링 현상이 발생하거나 비특이적 증폭 산물의 높은 배경 신호가 관찰될 경우, 연장 시간을 사이클당 15초/kb로 줄이십시오.

대부분의 표준 PCR 응용에는 25 µL 반응당 KAPA2G Robust DNA Polymerase 0.5 단위(또는 더 큰/작은 반응 용량에 비례하여 더 많거나 적게)가 충분합니다.

• 다음과 같은 경우에는 반응당 효소 양을 증가시키십시오:
  • GC 함량이 높은 증폭산물(25 µL 반응당 1 단위 또는 이에 상응하는 양 사용).
  • 원시 템플릿 또는 억제제가 포함된 템플릿의 경우 (25 µL 반응당 1-2 단위 또는 이에 상응하는 양 사용).
  • 긴 단편의 경우, 단 템플릿 사본 수가 높은 경우에만 (25 µL 반응당 1 단위 또는 이에 상응하는 양 사용).
• 다음의 경우 반응당 효소 양을 줄이십시오:
  • 특히 긴 단편 증폭 시 번짐 현상이 발생할 경우.
  • 템플릿 농도가 낮은 경우.
  • 비특이적 증폭 산물의 배경이 높게 나타날 때.

모든 KAPA2G 완충액 3종은 1.5 mM의 1X 농도로 MgCl₂를 포함하는 5X 완충액입니다. 추가적인 MgCl₂(25 mM)가 모든 키트에 포함되어 있어 추가 MgCl₂가 필요한 분석이나 최종 MgCl₂ 농도 최적화가 필요한 경우에 사용할 수 있습니다.

• 가능하다면 양질의 템플릿 DNA를 준비할 수 있는 형태로 표적 증폭 산물을 확보하십시오. 예를 들어 표적 단편을 플라스미드에 클로닝하십시오. 이것이 불가능할 경우, 프라이머 서열을 플라스미드에 클로닝하여 증폭 시 실제 표적과 유사한 크기와 GC 함량을 가진 증폭 산물이 생성되도록 인공 표적을 생성하십시오.
• 이 원천으로부터 템플릿 DNA를 정제하고, 이를 사용하여 기본 분석법 매개변수(시약 농도 및 사이클링 매개변수)를 설정 및 최적화하며, 분석법의 민감도(검출 가능한 최소 표적 복제수)를 결정하십시오.
• 실험용 템플릿의 10배 희석 시리즈를 준비합니다. 중복 반응을 설정하며, 한 세트에는 알려진 양의 표적 증폭산물(위에서 설명한 대로 인공적 출처에서 유래)을 첨가합니다. 인공적 대조군 표적의 양은 분석법 최적화 과정에서 양질의 DNA로 달성된 최소 검출 가능한 복제 수보다 10~100배 더 많아야 합니다.
• 이러한 희석 시리즈 실험 결과는 실험용 템플릿 내 억제 요소가 희석되어 제거될 수 있는지, 동시에 표적 증폭 산물에 대한 검출 범위 내에 남아 있는지 여부를 나타낼 것이다. 적합한 인공 제어 템플릿이 없는 경우, 동일한 반응 조건에서 효율적으로 증폭되는 다른 제어 증폭 산물의 템플릿을 첨가하고 두 번째 프라이머 세트를 반응에 포함시킬 수 있다.
• 광범위한 최적화 후에도 표적 증폭 산물의 농도가 매우 낮은 경우, 이 PCR의 산물을 2차 증폭에 사용하십시오. 2차 증폭에는 동일하거나 중첩된 프라이머 쌍을 사용할 수 있습니다. 1차 증폭 산물의 1μL를 원액, 10배 희석액, 100배 희석액 또는 1000배 희석액으로 각각 처리한 일련의 반응을 수행하십시오. 응용 분야에 따라 2차 PCR을 10~30사이클로 제한하십시오.

KAPA2G Robust HotStart는 KAPA2G Robust DNA 중합효소의 항체 매개 핫스타트 제형입니다. 실온에서 준비가 필요한 워크플로우에는 반드시 핫스타트 제형을 사용해야 합니다. 대부분의 분석에서 비핫스타트 및 핫스타트 제형은 유사한 결과를 나타낼 것입니다.

KAPA2G Robust 효소, KAPA2G 버퍼 A, B 및 GC 버퍼, KAPA Enhancer 1, dNTPs 및 MgCl₂의 장기 보관을 위한 권장 온도는 -20°C입니다. 그러나 이러한 키트 구성품 또는 이를 사용하여 조제한 PCR 마스터 믹스는 단기 사용(최대 1개월)을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.

KAPA2G Robust 효소는 세 가지 별개의 반응 완충액과 독점 첨가제인 KAPA Enhancer 1과 함께 제공됩니다. 이를 통해 최적화를 위한 다섯 가지 완충액/첨가제 조합을 제공합니다:

• KAPA2G 완충액 A
• KAPA2G 완충액 A + KAPA Enhancer 1
• KAPA2G 완충액 B
• KAPA2G 완충액 B + KAPA Enhancer 1
• KAPA2G GC 완충액(KAPA Enhancer 1과 혼합하지 마십시오)

특정 프라이머-템플릿 조합 또는 템플릿 유형에 대해 어떤 버퍼/첨가제 조합이 최상의 결과를 제공할지 예측하는 것은 불가능합니다. 그러나 다음 지침을 시작점으로 사용할 수 있습니다:

• 양질의 DNA 또는 GC 함량이 65% 미만인 증폭 산물의 경우 KAPA2G Buffer A(KAPA Enhancer 1 포함 또는 미포함)를 사용하십시오.
• 저품질 DNA, 음이온성 억제제가 포함된 DNA, 원시 샘플 또는 긴 증폭 산물의 경우 KAPA2G Buffer B(KAPA Enhancer 1 유무에 관계없이)를 사용하십시오.
• GC 함량이 65% 이상인 증폭산물에는 KAPA2G GC Buffer를 사용하십시오.

증폭이 어려운 고 GC 함량 증폭 산물의 경우 다음 추가 버퍼/첨가제 조합을 시도해 볼 수 있습니다:

• KAPA2G GC 버퍼 + 4% DMSO
• KAPA2G Buffer A + KAPA Enhancer 1 + 5% DMSO
• 새로운 분석법 개발 시, 추가 최적화 시도 전에 다섯 가지 기본 버퍼/첨가제 조합을 병행 평가하여 특정 산물의 최고 수율을 생성하는 조합을 결정할 것을 권장합니다.

KAPA Enhancer 1은 일부(모든 조합이 아닌) 프라이머-템플릿 조합에 대해 반응 효율성과 특이성을 향상시키는 독점적인 PCR 첨가제(DNA 불안정화제)입니다. 문제가 있는 분석의 경우, 추가 최적화를 시도하기 전에 먼저 KAPA2G Buffer A 또는 B를 1X KAPA Enhancer 1과 함께 또는 단독으로 사용해 보십시오. GC 버퍼와 KAPA Enhancer 1을 혼합하지 마십시오.

KAPA2G Robust 및 KAPA2G Robust HotStart PCR 키트에 포함된 버퍼는 새로운 KAPA2G Robust DNA 중합효소를 위해 특별히 개발되었으며, 키트에 포함된 버퍼/첨가제 조합을 우선적으로 평가할 것을 강력히 권장합니다. KAPA2G Robust 효소는 pH가 8.3 이상인 경우, 야생형 또는 핫스타트 Taq 사용을 위해 개발된 모든 PCR 버퍼와 호환됩니다. 맞춤형 버퍼를 사용할 경우 반응 매개변수(예: 효소, 템플릿 및 MgCl₂ 농도, 어닐링 온도)의 최적화가 필요할 수 있습니다.

KAPA2G 로버스트 버퍼는 다양한 반응 조건과 다양한 템플릿 및 증폭산물 유형에서 최적의 효소 성능을 발휘하도록 설계되었으며, 대부분의 응용 분야에서는 추가 첨가제가 필요하지 않습니다. 표준 반응(어떤 첨가제도 없이)으로 만족스러운 결과를 얻지 못할 경우, 항상 먼저 1X KAPA Enhancer 1(KAPA2G Buffer A 또는 B와 함께 사용) 또는 KAPA2G GC Buffer를 사용하여 결과를 개선해 보십시오. 그래도 효과가 없다면 다음 전략을 시도해 볼 수 있습니다:

• KAPA2G Buffer A 또는 B로 수행하는 반응에 최종 농도 1~10% DMSO를 포함시키십시오. KAPA2G GC Buffer로 수행하는 반응에는 최대 4% DMSO를 보충할 수 있습니다.
• 야생형 Taq에 일반적으로 사용되는 다른 PCR 첨가제(예: BSA, 글리세롤, 단일 가닥 결합 단백질, PEG, 글리신)를 반응에 포함시키십시오. KAPA2G Robust는 일반적으로 야생형 Taq보다 높은 농도의 첨가제를 허용하지만, 각 첨가제의 상대적 이점과 최적 농도는 경험적으로 결정해야 합니다.
• KAPA Enhancer 1은 베타인과 유사한 특성을 가집니다. 베타인 첨가로 효과가 입증된 모든 분석에서 베타인 대신 1X 농도로 사용할 수 있습니다. KAPA Enhancer 1과 베타인을 혼용하지 마십시오.
• 반응액에 5% 글리세롤 또는 0.1% 트윈 20을 첨가하면 긴 단편의 증폭 효율이 향상되는 경우가 많습니다. 그러나 3kb 이상의 증폭 산물을 안정적으로 증폭하려면 KAPA HiFi를 권장합니다.

KAPA2G Robust로 생성된 PCR 산물은 야생형 Taq 또는 해당 핫스타트 제형으로 생성된 PCR 산물과 동일한 특성을 가지며, 제한효소 처리 및 시퀀싱과 같은 일상적인 다운스트림 응용에 적합합니다. KAPA2G Robust로 생성된 PCR 산물은 3'-dA 꼬리 구조를 가지며, TA 클로닝에 바로 사용하거나 클로닝 전에 평단말 처리 또는 제한효소 분해를 수행할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 표준 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하는 것이 권장됩니다.

예. 권장 최종 농도로 KAPA2G Buffer A(KAPA Enhancer 1 포함 또는 미포함), KAPA2G Buffer B(KAPA Enhancer 1 포함 또는 미포함) 또는 KAPA2G GC Buffer를 사용하여 KAPA2G Robust 또는 KAPA2G Robust HotStart로 생성된 PCR 산물에는 광물유, 포르마미드, 프로테이나제 K, BSA, 고분자량 안정제(예: PEG), 세제(예: SDS, Triton X-100, Tween 20, Nonidet-P40), 글리세롤, 베타인 또는 DMSO를 Transgenomic WAVE dHPLC 시스템으로 직접 분석할 때 허용되는 최대 농도를 초과하는 최종 농도로 포함하지 않습니다.

KAPA2G Fast HotStart는 반응 시간 단축이 최우선 목표가 아닌 경우에도 (양질의 템플릿 DNA가 확보된 시점의) 멀티플렉스 PCR에 권장되는 제품입니다. 자세한 내용은 애플리케이션 노트: 멀티플렉스 PCR을 참조하십시오. 원시 샘플에서의 PCR은 일반적으로 양질의 정제된 DNA 템플릿을 사용했을 때보다 증폭 효율이 낮아 어려움이 따릅니다. 야생형 Taq 효소로 결과가 좋지 않은 경우, 증폭이 어려운 샘플, 조잡하게 추출된 샘플 또는 품질이 낮은 템플릿 DNA를 사용한 저복잡도 멀티플렉스 PCR 분석(2~3개의 프라이머 세트, 증폭 산물 <2kb)에는 KAPA2G Robust HotStart를 평가해 볼 수 있습니다. 반응 최적화가 필요할 가능성이 높습니다.

원시 샘플 PCR은 까다로운 응용 분야이며, 어떤 원시 샘플 유형에서 어떤 증폭 산물이 성공적으로 증폭될지 예측하기 어렵습니다. 아래 제시된 프로토콜은 KAPA2G Robust PCR 키트를 사용한 원시 템플릿 준비 및 원시 샘플 PCR의 시작점입니다.

• 검사 대상 시료의 소량(예: 2mm 잎 펀치, 2mm 조직 조각, 2µL 액체 시료)을 50µL의 10mM Tris-HCl(pH 8–8.5)에 넣고 15초간 보텍스합니다.
• 95°C에서 10분간 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후 15초간 교반합니다.
• 벤치탑 원심분리기로 최대 속도에서 1분간 원심분리하여 튜브 바닥에 잔여물을 모읍니다.
• 상층액을 새로운 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 5배 연속 희석액(10 mM Tris-HCl, pH 8–8.5)을 준비합니다. 최소 5개의 희석액을 준비하십시오.
• KAPA2G Robust 또는 KAPA2G Robust HotStart를 사용한 PCR 반응에 각 희석액 2.5 µL를 사용하며, 사용자 가이드의 반응 설정 조건을 따릅니다.
• 다음 사이클링 프로필로 시작하십시오: 초기 변성: 95°C에서 3분, 변성: 사이클당 15초(95°C); 어닐링: 사이클당 15초(55–65°C), 연장(72°C): 사이클당 30초/kb. 사이클 수: 35–40.
• 특정 샘플 유형에 최적화된 버퍼/첨가제 조합을 결정하기 위해 KAPA2G Buffer A와 KAPA2G Buffer B(KAPA Enhancer 1 포함 또는 미포함)를 병행 평가하십시오. 대부분의 경우 원시 샘플 PCR에는 Buffer B가 선호됩니다.
• GC 함량이 높은 증폭산물(60–70%)의 경우, KAPA2G GC Buffer 또는 KAPA2G Buffer B에 5% DMSO를 첨가한 조합을 평가하십시오.
• 1kb 이상의 증폭산물이나 고품질 DNA를 템플릿으로 사용할 때 야생형 Taq로 증폭하기 어려운 증폭산물에는 원시 샘플 PCR을 권장하지 않습니다.
• 생쥐 귀 또는 꼬리 용해물을 템플릿으로 사용하여 생쥐 유전자형 분석에 KAPA2G Robust를 사용하는 구체적인 방법은 응용 노트 '생쥐 유전자형 분석'을 참조하십시오.

• 25 µL 반응액당 1 단위 효소 또는 이에 상응하는 양을 사용하십시오.
• 초기 접근법으로 첨가제 없이 1X KAPA2G GC Buffer를 사용하십시오.
• 특히 저항성이 강한 템플릿/증폭물의 경우, 1X KAPA2G GC Buffer + 4% DMSO 또는 1X KAPA 2G Buffer A + 1x KAPA Enhancer 1 + 5% DMSO를 사용해 보십시오.
• 템플릿이 적절히 변성되었는지 확인하십시오. 초기 변성 시간으로 95°C에서 5–10분을 사용하거나 템플릿을 사전 변성하십시오. 각 사이클마다 95°C에서 15–30초 동안 변성하십시오.
• 자세한 내용은 응용 노트 'GC 풍부 PCR의 일상적 수행'을 참조하십시오.

• 반응액 25 µL당 0.5–1.0 U의 효소 또는 이에 상응하는 양을 사용하십시오.
• GC가 풍부한 증폭 산물의 경우 KAPA2G Buffer B 또는 KAPA2G GC Buffer를 사용하십시오. 경우에 따라 KAPA Enhancer 1을 사용하면 결과가 개선될 수 있습니다.
• 각 프라이머의 최종 농도는 0.5 μM, 각 dNTP의 최종 농도는 0.2 mM로 사용하십시오. 최종 MgCl₂ 농도 1.5 mM(모든 KAPA2G 버퍼의 1x 농도에 포함됨)는 대부분의 콜로니 PCR에 충분합니다. 수율이나 특이도가 낮거나 특정 증폭 산물이 더 높은 최적 MgCl₂ 농도를 필요로 하는 것으로 알려진 경우, 최종 농도를 2-5 mM MgCl₂로 보충할 수 있습니다. 여기에는 AT 풍부 템플릿도 포함됩니다.
• 25µL 반응당 10-20µL PCR 용수에 재현탁된 대장균 콜로니 1-2µL 또는 1µL의 하룻밤 배양액을 포함하십시오.
• 초기 변성 시간은 5분(95°C), 각 사이클당 변성 시간은 10~15초(95°C)로 설정하십시오.
• 사이클당 10~15초의 어닐링 시간을 사용하십시오.
• 증폭 산물이 500 bp 이하인 경우 사이클당 5초(72°C)의 연장 시간을, 500 bp 초과인 경우 사이클당 15~30초/kb의 연장 시간을 사용하십시오.
• 30 사이클로 시작하십시오. 수율에 따라 25 사이클로 줄이거나 35 사이클로 늘릴 수 있습니다.
• 자세한 내용은 응용 노트 '콜로니 PCR'을 참조하십시오.

• 반응 25 µL당 1.0 U 효소 또는 이에 상응하는 양을 사용하십시오.
• GC 함량이 높은 증폭 산물의 경우 KAPA2G Buffer B 또는 KAPA2G GC Buffer를 사용하십시오. 경우에 따라 KAPA Enhancer 1을 사용하면 결과가 개선될 수 있습니다.
• 각 프라이머의 최종 농도는 0.5 μM, 각 dNTP의 최종 농도는 0.2 mM로 사용하십시오. 최종 MgCl₂ 농도 1.5 mM(모든 KAPA2G 버퍼의 1x 농도에 포함됨)는 대부분의 콜로니 PCR에 충분합니다. 수율이나 특이도가 낮거나 특정 증폭 산물이 더 높은 최적 MgCl₂ 농도를 필요로 하는 것으로 알려진 경우, 최종 농도를 2-5 mM MgCl₂로 보충할 수 있습니다. 여기에는 AT 풍부 템플릿도 포함됩니다.
• 효모 세포(일박 배양된 콜로니 또는 배양액)를 0.1 M NaOH 또는 Zymolase로 37°C에서 최소 5분간 용해합니다.
• 25µL 반응당 용해된 효모 세포 현탁액 2.5µL를 포함합니다.
• 초기 변성 시간은 5분(95°C), 각 사이클당 변성 시간은 30초(95°C)로 설정하십시오.
• 사이클당 10~15초의 어닐링 시간을 사용하십시오.
• 증폭 산물이 500 bp 이하인 경우 사이클당 15초(72°C)의 연장 시간을, 500 bp 초과인 경우 사이클당 30초/kb의 연장 시간을 사용하십시오.
• 30 사이클로 시작하십시오. 수율에 따라 25 사이클로 줄이거나 35 사이클로 늘릴 수 있습니다.