KAPA2G 고속 PCR 키트 자주 묻는 질문

고속 PCR은 PCR 각 사이클에서 하나 이상의 단계 시간을 단축하여 총 반응 시간을 줄인 PCR 방식입니다. KAPA2G 고속 PCR 키트(제품 번호 2GFKB)를 사용하면 각 사이클의 연장 시간만 줄여도 PCR 시간을 20~70% 단축할 수 있습니다. 특정 분석법 및 열순환기에 맞춰 다른 사이클링 매개변수(예: 변성 및/또는 어닐링 시간)를 최적화함으로써 추가적인 시간 절약 효과를 얻을 수 있습니다.

KAPA2G Fast PCR 키트는 Taq 및 기타 DNA 중합효소보다 훨씬 빠르게 DNA를 합성할 수 있는 2세대 효소인 KAPA2G Fast DNA 중합효소를 함유하고 있어 독보적입니다. 광범위한 최적화, 특수 PCR 소모품 또는 전문 열순환기 없이도 고성능 고속 PCR이 가능합니다. 반면, 야생형 Taq 중합효소를 기반으로 한 경쟁사 키트는 Taq의 연장 속도에 제한을 받으며, 시간 절약은 주로 변성 및 어닐링 시간 단축에 의존합니다. 이러한 "인위적으로" 단축된 프로토콜은 특히 더 긴 증폭산물, 낮은 표적 복제수 및 더 빠른 열순환기를 사용할 경우 반응 효율 저하를 초래하는 경우가 많습니다.

• 변환에 권장되는 분석법:
  • 반응 용적이 25 µL를 초과하지 않고 양질의 표적 DNA가 충분히 사용되는 경우, 모든 표준 단일 증폭자말단 PCR 분석법
  • 단순 DNA(예: 플라스미드 또는 람다)에서 최대 5kb, 복합 DNA(예: 게놈)에서 최대 3.5kb 단편 증폭을 포함하는 반응
• 변환에 권장되지 않는 분석법:
  • 야생형 Taq와 호환성이 낮은 PCR 검사법
  • 최적화되지 않은 PCR 분석법
  • 광범위한 최적화 후에도 특정 산물의 낮은 수율을 생성하는 프라이머-템플릿 조합
  • 효율이 낮은 PCR 분석법
  • 지문 분석 PCR, 돌연변이 유도 PCR 또는 뉴클레오티드 유사체 도입을 수반하는 PCR과 같은 응용 분야

• 반응 설정
  • 시작 템플릿 양: 대부분의 응용 분야에서는 25 µL 반응당 10–25 ng 게놈 DNA 또는 1–10 ng 플라스미드/람다 DNA가 충분합니다.
  • 템플릿 품질: 성공적인 Fast PCR을 위해서는 분해되거나 억제제로 오염되지 않은 DNA가 필요합니다. A260/A280 비율이 1.7~2.0 사이인 템플릿 DNA만 사용하십시오.
  • 효소량: 25 µL 반응당 KAPA2G Fast 0.5 U를 사용하십시오.
  • 프라이머 및 dNTP 농도: 각 dNTP의 최종 농도는 0.2 mM, 각 프라이머의 최종 농도는 0.5 µM로 사용하십시오.
  • 게놈 표적 길이: KAPA2G Fast를 사용하면 플라스미드 또는 람다 DNA에서 최대 5kb의 단편을 증폭할 수 있지만, 3.5kb 이상의 게놈 표적의 빠른 증폭은 권장하지 않습니다.
  • 반응 용량: 25 µL의 반응 용량을 초과하지 마십시오.
• 사이클링 매개변수
  • 연장 시간: 1kb 이하 증폭물의 경우 사이클당 1초를 사용하십시오. 수율을 높이기 위해 사이클당 최대 5초까지 증가시킬 수 있습니다. 1kb 초과 증폭물의 경우 사이클당 15초/kb의 연장 시간을 사용하십시오. 지나치게 긴 연장 시간은 비특이적 증폭 및/또는 스미어링을 유발할 가능성이 높습니다.
  • 애닐링 시간: 사이클당 15초를 사용하거나, 느린 사이클러 또는 감소된 반응 용량(<25 µL)의 경우 사이클당 10초를 사용하십시오.
  • 애닐링 온도: 55–65 °C 범위 내의 애닐링 온도를 사용하거나, 검사에 최적의 애닐링 온도를 결정하기 위해 애닐링 온도 그라데이션 PCR(52–72 °C)을 수행하십시오.

권장 연장 시간은 증폭 산물 길이에 따라 달라집니다. 1kb 이하의 증폭 산물의 경우, 사이클당 1초의 연장 시간을 사용하십시오. 수율을 높이기 위해 사이클당 최대 5초까지 연장 시간을 늘릴 수 있습니다. 1kb 초과 증폭 산물의 경우, 사이클당 15초/kb의 연장 시간을 사용하십시오. 지나치게 긴 연장 시간은 비특이적 증폭 및/또는 스미어링을 유발할 가능성이 높습니다.

애닐링 시간이 너무 짧으면 낮은 수율이나 반응 실패를 초래할 수 있으며, 반대로 너무 길면 비특이적 증폭산물이나 스미어가 발생할 가능성이 높습니다. 사이클당 애닐링 시간을 15초 이상 사용하지 마십시오. 소량의 반응액(<25 µL)이나 느린 열순환기를 사용할 경우 사이클당 10초로 줄일 수 있습니다.

모든 PCR 검사에 대한 최적의 어닐링 온도는 특정 템플릿-프라이머 조합에 따라 달라집니다. Fast PCR 검사에 사용되는 프라이머는 55°C에서 65°C 사이의 어닐링 온도에서 사용하도록 설계되어야 합니다. 기존 검사를 Fast PCR 검사로 전환할 때는 첫 번째 접근법으로 야생형 Taq와 동일한 어닐링 온도로 시작하십시오. KAPA2G Fast PCR 키트로 특이적 산물의 최대 수율을 얻으려면 52~72°C 범위에서 어닐링 온도 그라데이션 PCR을 수행하십시오.

효율적인 변성은 반응 성능에 중요하며, 반응 구성 요소에 대한 효율적인 열 전달에 달려 있습니다. 반응 용적이 증가할수록 열전달 효율은 저하됩니다. 반응 튜브 내부의 온도는 열순환기 블록의 온도보다 뒤처지며, 이 온도 차이는 고속 순환기에서 저속 순환기보다 더 크게 나타납니다. 따라서 최적의 열전달을 보장하는 것이 중요합니다. 항상 최소 반응 용적(항상 25µL 미만), 열순환기 블록에 잘 맞는 얇은 벽의 PCR 튜브 또는 플레이트를 사용하고, 충분한 변성 시간을 확보하십시오.

KAPA2G Fast HotStart는 KAPA2G Fast DNA 중합효소와 최초 변성 단계까지 효소를 비활성화시키는 독점 항체로 구성됩니다. 이는 반응 설정 및 개시 과정에서 발생하는 비특이적 프라이밍에 의한 불필요한 증폭 산물을 제거하고, 전체 반응 효율과 감도를 향상시킵니다.

KAPA2G Fast HotStart ReadyMix는 KAPA2G Fast HotStart PCR 키트에 포함된 개별 시약 대신, Fast Multiplex PCR을 제외한 모든 Fast PCR 분석에 권장됩니다. 또한 대량 처리용 Fast PCR에 선호되는 제품입니다.

KAPA2G Fast ReadyMix 염색제는 핫스타트(HotStart) 제형이 필요하지 않고 분석 방법으로 아가로즈 겔 전기영동을 사용하는 일상적인 PCR에 권장됩니다. 이 ReadyMix에는 이미 로딩 염색제가 포함되어 있어 PCR 직후 PCR 산물을 겔에 직접 로딩할 수 있습니다.

KAPA2G Fast 효소, KAPA2G Buffer A, dNTP 및 MgCl₂의 장기 보관 권장 온도는 -20°C입니다. 그러나 이러한 키트 구성품 또는 이를 사용하여 조제한 PCR 마스터 믹스는 단기 사용(최대 1개월)을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.KAPA2G Fast 효소, KAPA2G Buffer A, dNTP 및 MgCl₂의 장기 보관 권장 온도는 -20°C입니다. 그러나 이러한 키트 구성품 또는 이를 사용하여 조제한 PCR 마스터 믹스는 단기 사용(최대 1개월)을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.

마그네슘이 포함되지 않은 버퍼 키트는 멀티플렉스 PCR 용도로만 권장됩니다. 이 키트는 KAPA2G Fast HotStart 효소와 함께만 제공됩니다. 마그네슘을 포함하지 않는다는 점을 제외하면 버퍼 A와 동일합니다.

KAPA2G Fast 및 Fast HotStart PCR 키트에 포함된 KAPA2G Buffer A는 고속 PCR을 위해 특별히 설계된 독점적 버퍼입니다. KAPA2G Fast 효소로 최적의 결과를 얻으려면 이 버퍼를 사용하는 것이 매우 권장됩니다. KAPA2G Fast 효소는 pH가 8.3 이상인 경우, 야생형 또는 핫스타트 Taq 사용을 위해 개발된 모든 표준 PCR 버퍼와 호환될 수 있습니다. 특수 버퍼에서의 최적 성능은 보장되지 않으며, 어닐링 온도와 시간, 그리고 연장 시간은 경험적으로 결정해야 할 가능성이 높습니다.

KAPA2G Fast PCR 키트는 첨가제가 필요한 검사에 권장되지 않습니다. 이러한 검사는 일반적으로 "어려운" 검사로 분류됩니다. 대신 KAPA2G Robust PCR 키트를 권장합니다. 다만, 최종 농도 5% 이하의 DMSO 존재 하에서 야생형 Taq로 성공적으로 수행된 검사의 경우 KAPA2G Fast 효소를 사용할 수 있습니다.

예, KAPA2G Fast 효소로 생성된 PCR 산물은 야생형 Taq 중합효소로 생성된 PCR 산물과 동일한 특성을 가집니다. 표준 프로토콜을 사용하여 시퀀싱하거나 제한 효소로 소화할 수 있습니다. 생성물은 3'-dA 꼬리 구조를 가지며 TA 클로닝에 바로 사용할 수 있습니다. 또는 클로닝 전에 평단말 처리하거나 제한효소로 소화할 수도 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 표준 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하는 것이 권장됩니다.

예. 권장 최종 농도의 KAPA2G Buffer A 또는 M을 사용하여 KAPA2G Fast 또는 KAPA2G Fast HotStart로 생성된 PCR 산물에는 광물유, 포름아미드, 프로테이나제 K, BSA, 고분자량 안정제(예: PEG), 세제(예: SDS, Triton X-100, Tween 20, Nonidet-P40), 글리세롤, 베타인 또는 DMSO를 Transgenomic WAVE dHPLC 시스템으로 직접 분석할 때 허용되는 최대 농도를 초과하는 최종 농도로 포함하지 않습니다. KAPA2G Fast HotStart ReadyMix로 생성된 PCR 산물은 Transgenomic WAVE dHPLC 시스템 분석 전 2.5배 이상 희석하거나 표준 PCR 정제 키트로 정제해야 합니다.

기존의 멀티플렉스 PCR 검사는 KAPA2G Fast HotStart를 사용하여 Fast 멀티플렉스 PCR 검사로 전환할 수 있습니다. Fast 멀티플렉스 PCR의 최적 반응 조건은 표준 단일 증폭자 검사에 권장되는 조건과 약간 다릅니다. Fast Multiplex PCR의 반응 조건 및 최적화 전략에 대한 자세한 내용은 KAPA2G Fast HotStart Multiplex PCR 애플리케이션 노트를 참조하십시오. Mg-free 버퍼가 포함된 KAPA2G Fast HotStart PCR 키트는 Mg 농도 최적화를 용이하게 하므로 Multiplex PCR 응용 분야에 권장됩니다.

KAPA2G 고속 PCR 키트는 블록이 장착된 기존 방식(펠티에 기반)의 모든 열순환기에서 표준 얇은 벽 PCR 튜브 또는 플레이트와 함께 고속 PCR에 사용할 수 있습니다. 이 키트를 사용하면 느린 순환기든 빠른 순환기든 관계없이 상당한 양의 PCR 시간을 절약할 수 있습니다. 최적의 성능을 위해 특정 장비의 대략적인 램핑(가열 및 냉각) 속도를 아는 것이 중요합니다. 고속 사이클러에서 총 반응 시간은 더 짧지만, 동일한 성능(수율/감도)을 보장하기 위해 각 PCR 단계에 프로그래밍된 시간은 저속 사이클러보다 더 길어야 할 수 있습니다.

2단계 프로파일은 65°C 이상 또는 65~72°C 범위에서 효과적으로 어닐링되는 프라이머 쌍에만 적합하며, 65°C 미만의 명확히 정의된 최적 어닐링 온도를 가진 기존 프라이머 쌍에는 권장되지 않습니다. 부적합한 프라이머로 3단계 분석법을 2단계 분석법으로 전환할 경우, 특히 고속 램핑 열순환기에서 반응 성능을 저하시키지 않으면서 반응 시간을 단축하려면 광범위한 최적화가 필요할 수 있습니다. 기존 3단계 분석법을 KAPA2G Fast DNA Polymerase의 고유한 고속 연장 속도를 적용하여 Fast 3단계 분석법으로 전환하면 광범위한 최적화나 반응 성능 저하 없이 상당한 시간을 절약할 수 있습니다.