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밀리셀® 마이크로웰 플레이트를 이용한 포스콜린 유발 부종 분석법

세포 배양에서의 포스콜린 유발 부종 분석법

낭포성 섬유증(CF) 치료제 개발 분야에서 새로운 방법론의 추구는 가장 중요한 과제이다. 이러한 접근법 중 하나는 포스콜린 유발 부종 분석법을 오가노이드 모델과 통합하는 것으로, 이는 CF 병리생리학을 규명하고 치료적 개입을 평가하는 데 유망한 기법이다. 

유도만능줄기세포(iPSCs) 또는 1차 조직에서 유래된 복잡한 3차원 구조인 오가노이드는 CF 관련 분자 및 세포 현상을 재현하는 생물학적으로 관련성 높은 플랫폼을 제공한다. 이 접근법의 핵심은 포스콜린에 의한 낭포성 섬유증 막전도도 조절자(CFTR) 활성화를 통해 염소 이온 수송을 평가하는 포스콜린 유발 부종 분석법으로, 이는 CFTR 기능성의 핵심 지표이다. 특히 Millicell® 마이크로웰 기술의 통합은 오가노이드 기반 분석의 효율성과 재현성을 향상시켜 CFTR 기능을 고처리량 방식으로 강력하게 분석할 수 있게 합니다.

여기서는 600µm Millicell® 마이크로웰 플레이트를 사용하여 단일 세포 현탁액으로부터 유사한 크기의 iPSC 유래 대장 오가노이드를 배양하고, 5일간의 시간 경과 기간 동안 모니터링합니다. 오가노이드 형성 5일 후, 포스콜린 유도 팽창 분석법을 활용하여 시간 경과 영상 촬영을 통해 약 26시간 동안 관찰함으로써 해당 오가노이드 내 CFTR의 기능성을 평가합니다.

밀리셀® 마이크로웰 플레이트를 만나보세요

 

재료

  • 600 µm Millicell 마이크로웰 플레이트 (MC96U6)
  • 3dGRO® iPSC 인간 대장 오가노이드 (SCC300)
  • 코닝® 매트리지엘® 기저막 매트릭스 (CLS354234)
  • 인산염 완충 식염수(PBS) (P2272)
  • ROCK 억제제 (SCM075)
  • TrypLE™ Express 효소
  • 혈구 계수기
  • Millicell® DCI 디지털 세포 이미저 (MDCI10000)
  • 트립판 블루 (T8154)
  • 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지 (SCM304)
  • DMSO (D8418)
  • 포스콜린 (F3917)
  • MuviCyte 기기

인간 iPSC 대장 오가노이드 배양 프로토콜

밀리셀 마이크로웰 플레이트에 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 사전 시딩 

  1. 냉장고에서 600 µm Millicell 마이크로웰 플레이트를 꺼내고, 외부 플라스틱 포장지와 함께 70% 알코올로 플레이트를 소독하십시오.
  2. 플레이트를 후드에 놓고 플레이트를 수평으로 유지한 상태에서 플라스틱 포장지를 제거합니다.
  3. 뚜껑와 밀봉층을 제거하십시오.
    참고: 밀봉층은 뚜껑 안쪽 또는 개봉된 플레이트 상단에 있을 수 있습니다.
  1. 피펫팅 포트와 세포 시딩 챔버에서 흡입 피펫을 사용하여 각 웰의 운송 버퍼를 제거하십시오. 자세한 지침은 사용자 가이드를 참조하십시오.
  2. 피펫팅 포트에 배양액 150µL를 첨가하고, 하이드로겔 마이크로웰을 재수화시키기 위해 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 최소 30분간 배지를 배양합니다.
밀리셀 마이크로웰 플레이트 준비 방법 개요. 피펫을 사용하여 운송용 완충액을 제거한 후 원하는 배양 배지를 첨가합니다. 측면 단면도는 왼쪽에 마이크로웰, 오른쪽에 피펫팅 포트를 보여줍니다. 상단 단면도는 웰 내부의 마이크로웰과 인접한 피펫팅 포트를 보여줍니다.

그림 1.밀리셀® 마이크로웰 플레이트 준비 개요도. A. 및 B. 세포 시딩 챔버와 피펫팅 포트에서 운송 버퍼를 제거합니다. C. 피펫팅 포트에 배양액 150 µL를 첨가합니다.

3dGRO® 인간 대장 오가노이드 시딩 준비 

본 프로토콜은 각각 80-90% 점유율을 가진 20 x 25 µL 돔을 기준으로 합니다.

  1. 배양 7일차에 3dGRO® 인간 대장 오가노이드(SCC300)가 담긴 20 x 25 µL Matrigel® 돔이 있는 6-웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 조직 배양 후드에 놓습니다.
  2. 배지를 흡인하고 20 x 25 µL Matrigel® 돔이 있는 웰에 얼음처럼 차가운 1X PBS + 10µM ROCK 억제제 1mL를 첨가합니다.
    참고: 3dGRO® 인간 대장 오가노이드의 20 x 25 µL 돔은 96-웰 Millicell® 마이크로웰 플레이트의 60개 웰에 200 세포/µwell로 시드하기에 충분합니다. 전체 플레이트에 200 cells/µwell로 시드하기 위해서는 3dGRO® Human Colon Organoid 돔을 최소 40 x 25 µL 사용하며, 각 돔의 점유율을 약 80-90%로 유지하는 것이 권장됩니다.
  1. 모든 돔이 분리되고 분해될 때까지 돔에 1X PBS + 10 µM ROCK 억제제 1mL를 주입하여 P-1000 피펫으로 Matrigel® 돔을 분리합니다.
  2. 오가노이드 + Matrigel® 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
    참고: 15mL 원뿔형 튜브당 최대 20 x 25µL 돔을 사용하십시오. 20 x 25µL 돔이 더 많은 경우 추가 15mL 원뿔형 튜브를 사용하십시오.
     
  1. 잔여 매트리지엘® 돔을 1mL의 얼음처럼 차가운 1X PBS + 10µM ROCK 억제제로 웰에서 세척한 후, 다른 돔과 함께 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  2. 4°C에서 1500 rpm으로 10분간 원심 분리합니다.
  3. 튜브를 조직 배양 후드로 옮긴 후, P-200 피펫 팁이 연결된 흡입 피펫으로 상층액과 Matrigel® 층을 조심스럽게 흡입 제거합니다.
  4. 1mL의 얼음처럼 차가운 1X PBS + 10 µM ROCK 억제제로 펠릿을 세척합니다. 피펫을 4~5회 위아래로 움직여 세척합니다.
  5. 4°C에서 1500 rpm으로 10분간 원심 분리합니다.
  6. 튜브를 조직 배양 후드로 옮기고, P-200 피펫 팁이 연결된 흡입 피펫으로 상층액과 Matrigel® 층을 조심스럽게 제거합니다.
  7. 펠릿에 TrypLE™ Express + 10µM ROCK 억제제 1mL를 첨가하고 위아래로 10회 격렬하게 피펫팅합니다. 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 45-60분 동안 두며, 현탁액이 대부분 단일 세포가 될 때까지 5분마다 피펫팅합니다.
  8. 37°C에서 20분간 배양한 후 10µL 샘플을 채취하여 혈구계수판에 첨가합니다.
  9. Millicell® DCI 디지털 세포 이미저와 같은 현미경으로 세포를 관찰하여 대부분이 단일 세포인지 확인하십시오.
    참고: 유사한 크기의 오가노이드를 얻기 위해서는 시드하기 전에 세포가 대부분 단일 세포 상태여야 합니다.
  1. 현탁액이 대부분 단일 세포가 될 때까지 20분 후 5분마다 이 단계를 반복합니다.
  2. 현탁액이 단일 세포로 분해되면, 단일 세포 현탁액 40 µL를 취하고 트리판 블루 40 µL를 첨가합니다.
  3. 나머지 현탁액에 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지(SCM304) + 10 µM ROCK 억제제 4 mL를 첨가하고 4°C에서 1500 rpm으로 5분간 원심 분리합니다.
  4. 원심 분리하는 동안, 10µL의 세포 + 트리판 블루 현탁액을 헤모시터미터의 양쪽에 각각 넣고 계수합니다.
  5. 튜브를 조직 배양 후드로 옮기고 P-200 피펫 팁이 연결된 흡입 피펫으로 상층액을 조심스럽게 흡입 제거합니다.

600 µm Millicell® 마이크로웰 플레이트에 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 시드하기

  1. 위 23단계에서 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지 + 10 µM ROCK 억제제에 재현탁하여 세포 농도를 220,000 세포/mL로 조정합니다.
      참고: 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 20 x 25 µL 돔은 96-웰 Millicell® 마이크로웰 플레이트의 60개 웰에 200 세포/µwell로 시드하기에 충분합니다. 전체 96웰에 200,000 세포/µwell로 시드하기 위해서는 최소 40 x 25 µL의 3dGRO®
    Human Colon Organoid 돔을 약 80% 이상의 점유율로 사용하는 것이 권장됩니다.
  1. 5% CO2가 공급되는 37°C 인큐베이터에서 Millicell® 마이크로웰 플레이트를 꺼내고, 피펫팅 포트와 세포 시딩 챔버에서 흡입 피펫으로 배지를 제거하십시오(그림 2). 자세한 지침은 사용자 가이드를 참조하십시오. 
  2. 세포를 멸균 저장 용기로 옮긴 후, 12채널 피펫을 사용하여 600µm Millicell® 마이크로웰 플레이트의 세포 시딩 챔버 중앙 바로 위에 50µL의 세포를 시딩하여 웰당 200개의 세포를 배양합니다(그림 2). 
  3. 세포를 37°C 인큐베이터에서 20-30분간 침강시킵니다. 
  4. 세포 배양 중, 충분한 양의 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지 + 10 µM ROCK 억제제 + 2.1% GFR Matrigel®을 준비하십시오.
    참고: GFR Matrigel®을 첨가하기 전에 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지 + ROCK 억제제가 얼음처럼 차가운 상태인지 확인하십시오.
  1. 플레이트를 조직 배양 후드로 옮기고, 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 웰의 피펫팅 포트에 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지 + 10 µM ROCK 억제제 + 2.1% GFR Matrigel® 150 µL를 아주 천천히 첨가합니다(그림 2).
    참고: GFR Matrigel®의 최종 농도는 1.6%여야 합니다.
  1. Millicell® 마이크로웰 플레이트를 5% CO₂ 조건의 37°C 인큐베이터에 넣어 배양합니다.
    참고: 오가노이드 형성에 4-5일이 소요됩니다.
그림 2는 결합된 파일이 필요합니다.

그림 2.3dGRO® 인간 대장 오가노이드에서 단일 세포를 Millicell® 마이크로웰 플레이트에 시드하는 개략도. 피펫팅 포트와 세포 시드 챔버 양쪽에서 배지를 흡인함(단계 25). 세포 시드 챔버 중심부 바로 위에 단일 세포 현탁액을 시드함(단계 26). 피펫팅 포트를 통해 웰에 배지를 매우 천천히 첨가함(단계 29).

밀리셀 마이크로웰 플레이트의 웰에 대한 현미경 이미지. 웰 내에는 여러 개의 마이크로웰이 있으며, 각 마이크로웰에는 더 작은 덩어리 형태의 대장 오가노이드가 표시되어 있습니다. A, B, C, D에서 오가노이드는 느슨한 세포 덩어리에서 완전한 오가노이드로 형성됩니다. 5일간의 시간 경과에 따른 형성 과정.

그림 3.3dGRO® 인간 대장 오가노이드(SCC300)의 5일 간 600 µm Millicell® 마이크로웰 플레이트에서의 형성 과정 타임랩스 정지 이미지. A. 배양 시작일(day 0) 직후, 웰당 200개 세포로 시드된 SCC300, B. 배양 1일차(day 1) SCC300 오가노이드 형성, C. 배양 3일차(day 3) SCC300 오가노이드 형성, D. 배양 5일차(day 5) SCC300 오가노이드 형성.

(전체 화면 확장 옵션을 사용하여 시청하십시오.)

그림 4. 600 µm Millicell® 마이크로웰 플레이트에서 109시간에 걸쳐 형성된 3dGRO® 인간 대장 오가노이드(SCC300)의 타임랩스 영상. SCC300은 웰당 200개 세포로 시드되었습니다. 

포스콜린 유발 부종 분석 프로토콜

배양 시작 5일차부터 포스콜린 유발 부종 분석(FIS)을 시작하십시오. 

  1. 시험 시작 전에 26.67 µM 포스콜린 및 그 용매(0.267% DMSO)를 함유한 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지 + 10 µM ROCK 억제제 + 1% GFR Matrigel®을 충분히 준비하십시오.
  2. 시드 후 5일째에 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 3dGRO® 인간 대장 오가노이드가 포함된 600 µm Millicell® 마이크로웰 플레이트를 꺼내 조직 배양 후드에 놓습니다.
  3. P-200 멀티 채널 피펫을 사용하여 피펫팅 포트를 통해 각 웰에서 150 µL의 배지를 제거하십시오. 자세한 지침은 사용자 설명서를 참조하십시오.
  4. 처리되지 않은 대조군, 용매 대조군 및 포스콜린 처리군 샘플을 각각 별도의 멸균 저장 용기에 옮깁니다.
  5. FIS 분석을 다음과 같이 설정하십시오:
    • 미처리 샘플: 피펫팅 포트를 통해 적절한 웰에 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지 + 10µM ROCK 억제제 + 1% GFR Matrigel® 150 µL를 매우 천천히 첨가합니다.  
    • 차량 대조군 샘플: 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지 + 10µM ROCK 억제제 + 1% GFR Matrigel® + 0.267% DMSO 150µL를 피펫팅 포트를 통해 해당 웰에 아주 천천히 첨가합니다.  
    • 포스콜린 샘플의 경우: 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 확장 배지 + 10µM ROCK 억제제 + 1% GFR Matrigel® + 26.67 µM 포스콜린 150 µL를 피펫팅 포트를 통해 해당 웰에 아주 천천히 첨가합니다. 
  6. 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터 내 MuviCyte 장비로 옮겨 원하는 기간 동안 팽창 과정을 타임랩스 영상으로 촬영합니다. 본 실험에서는 37분 간격으로 총 42회 촬영하여 약 26시간 동안의 타임랩스 영상을 획득했습니다(그림 5). 
대장 장기유사체를 이용한 포스콜린 유발 부종 분석의 시간 경과 현미경 이미지. 상단 세 장은 기준선 상태이며 하단 세 장은 분석 4.3시간 후 상태이다. 여섯 개의 웰 각각에는 마이크로웰이 포함되어 있으며, 마이크로웰 내부에 장기유사체가 위치한다. 이미지는 세 그룹으로 구분되며, 첫 두 그룹은 포스콜린 미첨가 대조군, 두 번째 두 그룹은 0.2% DMSO 용매군, 마지막 두 그룹은 20 µM 포스콜린 처리군이다.

그림 5.3dGRO® 인간 대장 오가노이드에서 포스콜린 유발 부종(FIS) 분석의 타임랩스 영상. 포스콜린 미처리 대조군: 기준선 및 4.3시간 후 (웰 G7). 용매 대조군 (0.2% DMSO): 기준선 및 4.3시간 후 (웰 D8). 시험 시료 @ 20 µM 포스콜린 처리 시점(기준선) 및 4.3시간 후 (웰 D7). 웰 D7의 빨간색 원은 기준선 대비 4.3시간 후 팽창한 오가노이드의 예시를 나타냅니다.

(전체 화면 확장 옵션을 사용하여 시청하십시오.)

그림 6. 3dGRO® 인간 대장 오가노이드에서 포스콜린 유발 부종 분석의 시간 경과 영상. 포스콜린 미처리 대조군: 기준선 및 4.3시간 후 (웰 G7). 용매 대조군 (0.2% DMSO): 기준선 및 4.3시간 후 (웰 D8). 시험 시료 @ 20 µM 포스콜린: 기준선 및 4.3시간 후 (웰 D7).

팁과 요령

  • HepG2 세포와 3dGRO® 인간 대장 오가노이드 모두 Millicell® 마이크로웰 플레이트에 완전히 단일 세포로 분해되었는지 확인하십시오. 이는 유사한 크기의 스페로이드/오가노이드 생성에 도움이 됩니다.
  • 배지 교체 시 피펫팅 포트를 통해 부드럽고 천천히 진행하십시오. 배지를 너무 빠르게 제거하거나 추가하면 마이크로웰 내 스페로이드/오가노이드가 손상될 수 있습니다.
  • hu iPSC 유래 대장 오가노이드의 경우, 세포 접종 완료 시점에 확장 배지 150µL + 2.1% GFR Matrigel® + 10µM ROCKi를 첨가해야 합니다. 접종 후 최종 GFR Matrigel® 농도는 1.6%여야 합니다. 현탁 상태의 오가노이드는 성장에 매우 낮은 농도의 GFR Matrigel®만 필요합니다. GFR Matrigel®최종 농도는 1-2% 사이로 시작하는 것이 권장됩니다.
  • 인간 iPSC 유래 대장 오가노이드의 경우, 확장 배지에 항상 10 µM ROCKi + 1% GFR Matrigel®을 포함시키고 시드 후 2일마다 배지를 교체하십시오. ROCKi는 단일 세포 분리한 인간 iPSC 유래 대장 오가노이드가 성장하고 오가노이드를 형성하도록 유지하는 데 필요합니다.
  • 인간 iPSC 유래 대장 오가노이드의 경우, 단일 세포 현탁액에서 Millicell® 마이크로웰 플레이트로 오가노이드를 생성할 때는 15세대 이하를 사용하는 것이 좋습니다.

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