Mezcla de marcaje de ARN DIG

Función probada en el kit de etiquetado del ARN con DIG y en el kit de detección de ácido nucleico DIG.

Marcaje de ARN con digoxigenina-11-UTP mediante transcripción in vitro con ARN polimerasas SP6, T7 y T3. El ARN etiquetado con DIG se utiliza en una variedad de técnicas de hibridación:

• Inmunotransferencias Northern
• Inmunotransferencias de Southern
• Inmunotransferencia por puntos (dot blot)
• Transferencia de placas o colonias
• Experimentos de protección de ARNasa
• Cromosomas, células y secciones de tejidos in situ

Inactivación por calor: Interrupción de la reacción añadiendo 2 μl de EDTA 0,2 M (pH 8,0).

La mezcla de etiquetado del ARN con DIG está diseñada en especial para su uso con las ARN polimerasas SP6, T7 y T3 de Roche que se suministran con una disolución tampón de transcripción optimizada.

Eficiencia de marcaje: Se transcriben aproximadamente 10μg de ARN de longitud completa marcado con digoxigenina a partir de 1μg de plantilla de ADN lineal
Tiempo de análisis: 135 minutos
Materiales de muestra
ADN plasmídico linealizado:
El ADN que va a transcribirse se clona en el sitio de policlonación (polylinker) de un vector de transcripción apropiado que contiene adyacente al sitio de policlonación un promotor para la ARN polimerasa SP6, T7 o T3. Para la síntesis de transcritos «run off» el plásmido se linealiza por medio de una enzima de restricción. Deben utilizarse enzimas de restricción que creen protuberancias 5′; las protuberancias 3′ deben evitarse. El ADN linealizado de la plantilla debe purificarse mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol para evitar contaminación con ARNasa Para la transcripción ′run around′ se utiliza ADN plasmídico circular.
Producto de PCR:
También pueden utilizarse como plantillas para la transcripción fragmentos de la PCR que contengan secuencias promotoras de la ARN polimerasa. Se recomienda la purificación de los fragmentos de la PCR mediante purificación en columna HighPure antes de la transcripción.

Las sondas de ARN monocatenario etiquetado con DIG de longitud definida se generan mediante transcripción in vitro. El DIG-11-UTP es incorporado por las ARN polimerasas SP6, T7 y T3 aproximadamente cada 20 a 25 nucleótidos del transcrito en condiciones estándar. La mezcla de marcaje del ARN con DIG está diseñada específicamente para su uso con las ARN polimerasas SP6, T7 y T3 que se suministran con una disolución tampón de transcripción optimizada.
Cómoda mezcla de nucleótidos para el marcaje del ARN con Digoxigenina-11-UTP.

Contenido
Disolución a concentración x10 con: ATP, CTP, GTP (cada uno) 10 mM, UTP 6,5 mM, DIG-11-UTP 3,5 mM.

Sólo para investigación en ciencias de la vida. No indicada para procedimientos diagnósticos.