Guide technique : test de viabilité et de prolifération cellulaires au XTT

Introduction

Le kit de test de prolifération cellulaire II (test au XTT) (réf. 11465015001) est un dosage colorimétrique qui permet la quantification non radioactive de la prolifération, de la viabilité et de la toxicité cellulaires. Les échantillons sont des cellules adhérentes ou des cellules en suspension cultivées sur des microplaques de 96 puits. Le système de dosage colorimétrique non radioactif au XTT {sel sodique hydraté de l'acide 3'-[1-(phénylaminocarbonyl)-3,4-tétrazolium]-bis(4-méthoxy-6-nitro)benzènesulfonique} a été décrit pour la première fois par Scudiero, P.A. et al.^1,2, avant d'être amélioré par plusieurs autres chercheurs dans les années suivantes^3,4. Le test au XTT est utilisé pour mesurer l'activité métabolique des cellules, en tant qu'indicateur de la viabilité, de la prolifération et de la toxicité cellulaires. Ce dosage colorimétrique s'appuie sur la réduction d'un sel de tétrazolium jaune, le sel sodique hydraté de l'acide 3'-[1-(phénylaminocarbonyl)-3,4-tétrazolium]-bis(4-méthoxy-6-nitro)benzènesulfonique (XTT), en un colorant orange, le formazan, par les cellules métaboliquement actives (Figure 1)⁵. Le formazan formé est soluble en solution aqueuse ; il et est directement quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre multipuits à balayage (lecteur ELISA). Un accroissement du nombre de cellules vivantes se traduit par une augmentation générale de l'activité des déshydrogénases mitochondriales présentes dans l'échantillon. Cette augmentation est directement corrélée avec la quantité de formazan orange formée, dont l'absorbance permet de suivre l'évolution (Figure 2).

Ce kit est utilisé pour mesurer la prolifération cellulaire en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines ou des nutriments (Figure 2). Il sert également à mesurer la cytotoxicité, par exemple en quantifiant les effets du facteur de nécrose tumorale alpha ou bêta (Figure 3) ou en évaluant des agents cytotoxiques ou des inhibiteurs de croissance comme les anticorps bloquants.

Composants du kit de test de prolifération cellulaire II (test au XTT) 

Réactif au XTT

• 5 flacons contenant 25 ml de XTT {sel sodique hydraté de l'acide 3'-[1-(phénylaminocarbonyl)-3,4-tétrazolium]-bis(4-méthoxy-6-nitro)benzènesulfonique} à 1 mg/ml dans du RPMI 1640

Réactif de couplage électronique

• 5 × 0,5 ml de PMS (méthylsulfate de N-méthyl-dibenzopyrazine)

Préparation du mélange de marquage au XTT

• Décongeler le réactif de marquage au XTT et le réactif de couplage électronique au bain-marie à 37 °C. Bien mélanger chaque flacon de façon à obtenir une solution limpide.
• Pour effectuer un test de prolifération cellulaire (test au XTT) sur une microplaque (96 puits), mélanger 5 ml de réactif de marquage au XTT avec 0,1 ml de réactif de couplage électronique.
  Remarque : Pour garantir la fiabilité des résultats, attendre le dernier moment pour décongeler et mélanger les réactifs.

Protocole de test pour la mesure de la croissance cellulaire

Ce test permet de déterminer l'activité de l'interleukine 6 humaine (hIL-6) sur les cellules 7TD1 (lignée cellulaire d'hybridome souris/souris, DSMZ, ACC 23) (Figure 2).

Autres réactifs nécessaires :

• Milieu de culture (p. ex. DMEM, réf. D5671) contenant 10% de sérum de veau fœtal inactivé par chauffage (FBS, réf. 12106C), de la glutamine 2 mM (réf. G6392), de la L-arginine 0,55 mM (réf. A8094), de la L-asparagine monohydratée 0,24 mM (réf. A4284), du 2-mercaptoéthanol 50 µM (réf. M3148) et du supplément HT pour milieux de culture (réf. H0137) (concentré 1 ×) contenant de l'hypoxanthine 0,1 mM et de la thymidine 16 µM.
• Interleukine 6 humaine (hIL-6, réf. SRP3096) (200 000 U/ml, 2 μg/ml) stérile.
• En cas d'utilisation d'un antibiotique, supplémenter également le milieu en pénicilline/streptomycine ou en gentamicine.

Protocole :

1. Ensemencer les cellules 7TD1 à raison de 4 × 10³ cellules/puits dans 100 μl de milieu de culture contenant diverses quantités d'IL-6 [exemple de concentration finale : 0,1 à 10 U/ml (0,001 à 1 ng/ml)] sur des microplaques (qualité "culture tissulaire", 96 puits, à fond plat).
2. Incuber les cultures cellulaires pendant 4 jours à +37 °C sous 5 % à 6,5 % de CO₂.
3. Ajouter 50 µl de mélange de marquage au XTT par puits et incuber pendant 4 heures à 37 °C sous 5 % à 6,5 % de CO₂.
4. Mesurer l'absorbance spectrophotométrique des échantillons à l'aide d'un lecteur de microplaques (lecteur ELISA). La longueur d'onde de mesure de l'absorbance du formazan se situe entre 450 nm et 500 nm, selon les filtres disponibles pour le lecteur ELISA utilisé. La longueur d'onde de référence doit être supérieure à 650 nm.

Protocole de test pour la mesure de la cytotoxicité

Ce test permet de déterminer les effets cytotoxiques du facteur de nécrose tumorale α humain (hTNF-α, T6674) sur les cellules WEHI-164 (lignée cellulaire de fibrosarcome de souris, réf. 87022501) (Figure 3).

Autres réactifs nécessaires :

• Milieu de culture (p. ex. RPMI 1640, réf. R0883) contenant 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par chauffage (FBS, réf. 12106C), de la glutamine 2 mM (réf. G6392) et 1 µg/ml d'actinomycine C1 (actinomycine D, réf. A9415).
• Facteur de nécrose tumorale α humain (hTNF-α, réf. T6674) (10 μg/ml) stérile.
• En cas d'utilisation d'un antibiotique, supplémenter également le milieu en pénicilline/streptomycine ou en gentamicine.

Protocole :

1. Préincuber les cellules WEHI-164 à une concentration de 1 × 10⁶ cellules/ml dans le milieu de culture contenant 1 μg/ml d'actinomycine C1 pendant 3 heures à 37 °C sous 5 % à 6,5 % de CO₂.
2. Ensemencer les cellules à raison de 5 × 10⁴ cellules/puits dans 100 μl de milieu de culture contenant 1 μg/ml d'actinomycine C1 et diverses quantités de hTNF-α (exemple de concentration finale : 0,001 à 0,5 ng/ml) sur des microplaques (qualité "culture tissulaire", 96 puits, à fond plat).
3. Incuber les cultures cellulaires pendant 24 heures à +37 °C sous 5 % à 6,5 % de CO₂.
4. Ajouter 50 µl du mélange de marquage au XTT et incuber pendant 18 heures à 37 °C sous 5 % à 6,5 % de CO₂.
5. Mesurer l'absorbance des échantillons à l'aide d'un lecteur de microplaques (lecteur ELISA). La longueur d'onde de mesure de l'absorbance du formazan se situe entre 550 nm et 600 nm, selon les filtres disponibles pour le lecteur ELISA utilisé. La longueur d'onde de référence doit être supérieure à 650 nm.

Tests similaires

Le test au MTT et le test au WST-1 peuvent également être utilisés pour mesurer la viabilité et la prolifération cellulaires.