ApopTag PlusペルオキシダーゼIn Situアポトーシスキット

INTRODUCTION

ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kits label apoptotic cells in research samples by modifying DNA fragments utilizing terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) for detection of apoptotic cells by specific staining.

This manual contains information and protocols for the ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit.

Principles of the Procedure

The reagents provided in ApopTag Peroxidase Kits are designed to label the free 3′OH DNA termini in situ with chemically labeled and unlabeled nucleotides. The nucleotides contained in the Reaction Buffer are enzymatically added to the DNA by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) (13, 31). TdT catalyzes a template-independent addition of nucleotide triphosphates to the 3′-OH ends of double-stranded or single-stranded DNA. The incorporated nucleotides form an oligomer composed of digoxigenin-conjugated nucleotide and unlabeled nucleotide in a random sequence. The ratio of labeled to unlabeled nucleotide in ApopTag Peroxidase Kits is optimized to promote anti-digoxigenin antibody binding. The exact length of the oligomer added has not been measured.

DNA fragments which have been labeled with the digoxigenin-nucleotide are then allowed to bind an anti-digoxigenin antibody that is conjugated to a peroxidase reporter molecule (Figure 1A). The bound peroxidase antibody conjugate enzymatically generates a permanent, intense, localized stain from chromogenic substrates, providing sensitive detection in immunohistochemistry or immunocytochemistry (i.e. on tissue or cells). This mixed molecular biological-histochemical systems allows for sensitive and specific staining of very high concentrations of 3′-OH ends that are localized in apoptotic bodies.



The ApopTag system differs significantly from previously described in situ labeling techniques for apoptosis (13, 16, 38, 46), in which avidin binding to cellular biotin can be a source of error. The digoxigenin/anti-digoxigenin system has been found to be equally sensitive to avidin/biotin systems (22). The sole natural source of digoxigenin is the digitalis plant. Immunochemically-similar ligands for binding of the anti-digoxigenin antibody are generally insignificant in animal tissues, ensuring low background staining. Affinity purified sheep polyclonal antibody is the specific anti-digoxigenin reagent used in ApopTag Kits. This antibody exhibits <1% cross-reactivity with the major vertebrate steroids. In addition, the Fc portion of this antibody has been removed by proteolytic digestion to eliminate any non-specific adsorption to cellular Fc receptors.

Results using ApopTag Kits have been widely published (see Sec. V. References, Publications Citing ApopTag Kits). The ApopTag product line provides various options in experimental design. A researcher can choose to detect staining by brightfield or fluorescence microscopy or by flow cytometry, depending on available expertise and equipment. There are also opportunities to study other proteins of interest in the context of apoptosis when using ApopTag Kits. By using antibodies conjugated with an enzyme other than peroxidase and an appropriate choice of substrate, it is possible to simultaneously examine another protein and apoptosis using ApopTag Peroxidase Kits.

メルクのカタログまたは製品に添付されたメルクのその他の文書に記載されていない場合、メルクの製品は研究用途のみを目的としているため、他のいかなる目的にも使用することはできません。このような目的としては、未承認の商業用途、in vitroの診断用途、ex vivoあるいはin vivoの治療用途、またはヒトあるいは動物へのあらゆる種類の消費あるいは適用などがありますが、これらに限定されません。

ApopTag PlusペルオキシダーゼIn Situアポトーシス検出キットは、間接TUNEL法によってDNA鎖切断を標識して検出することにより、アポトーシス細胞を検出します。キットには、40サンプルの免疫ペルオキシダーゼ染色に十分な試薬に加え、ApopTag(R)ポジティブコントロールスライドと、DABバッファーおよび基質が含まれています。結果は、明視野顕微鏡検査法によって可視化されます。

ApopTagペルオキシダーゼキットは、次の検体の組織化学および細胞化学染色での使用が認定されています：ホルマリン固定、パラフィン包埋組織、クライオスタット切片、細胞懸濁液、サイトスピン、および細胞培養。ホールマウント法が開発されています（34, 45）。（データシート Sec. V. 参考文献を参照）。

ApopTagペルオキシダーゼキットの染色特異性は、Chemiconおよび他の多くのラボによって実証されています。Chemiconは、次のような数多くのタイプのモデル細胞および組織系をテストしています：(a) ヒト前立腺、胸腺、および大腸（社内データ）、(b) 去勢後ラット腹側前立腺（21）、(c) デキサメタゾンによりin vitro処理したラット胸腺リンパ球（3, 13）、(d) 14日目マウス胎児の手足（1）および (e) 離乳後に退縮しているラット乳腺（36）。胸腺細胞と前立腺のモデルでは、アガロースゲル電気泳動を使用してDNAラダーリングの量を評価しました。この量は、染色された細胞のパーセンテージが最大になると同時にピークに達しました。世界中のラボが発表した数多くの学術論文によって、ApopTagキットの有用性が確立されています。（データシート Sec.V. 参考文献、ApopTagキットを引用している公表文献を参照）。

平衡バッファー 90416 3.0 mL -15°C～-25°C

反応バッファー 91417 2.0 mL -15°C～-25°C

TdT酵素 90418 0.672 mL -15°C～-25°C

停止／洗浄バッファー 90419 20 mL -15°C～-25°C

抗ジゴキシゲニン-ペルオキシダーゼ* 90420 3.0 mL 2°C～8°C

プラスチックカバースリップ 90421 100 ea. 室温

コントロールスライド 90422 2個ずつ 室温

DAB基質 90423 130 μL 2°C～8°C

DAB希釈用バッファー 90424 6.5 mL 2°C～8°C

*アフィニティー精製ヒツジポリクローナル抗体

キットあたりのサンプル数：説明書通りに使用した場合に、約5 cm2の組織検体を40回染色するために十分な資材が含まれています。スライドマウント検体にキットを使用する場合は、反応バッファーを使い果たしてから別の試薬を使用します。

最初に使用するまでは、キットを-15°C～-25°Cで保存してください。最初に使用した後、キットを3か月以内に使用する場合は、TdT酵素（90418）は-15°C～-25°Cで保存し、その他の構成要素は2°C～8°Cで保存してください。

使用上の注意

1.以下のキット構成要素には、バッファーとしてカコジル酸カリウム（ジメチルアルシン酸）が含まれています：平衡バッファー（90416）、反応バッファー（90417）、TdT酵素（90418）。これらの構成要素は飲み込むと有害です。皮膚と眼への接触を避け（手袋、眼鏡を着用）、接触した部位はすぐに洗ってください。

2.DAB（3,3′ジアミノベンジジン）基質（90423）は潜在性発癌物質であることが示されているため、皮膚との接触は避けてください。皮膚との接触が生じた場合は、大量のdH2Oで洗い流してください。

3. 抗体コンジュゲート（90420）には、保存剤として0.08%アジ化ナトリウムが含まれています。

4. TdT酵素（90418）にはグリセロールが含まれており、-20°Cでは凍りません。有効期間を最長にするため、分注する前にこの試薬が室温まで温まらないようにしてください。

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany