ApopTag Plus In Situアポトーシスフルオレセイン検出キット

ApopTag PlusフルオレセインIn Situアポトーシス検出キットは、フルオレセインレポーター分子にコンジュゲートさせた抗ジゴキシゲニン抗体を用いた間接TUNEL法により、in situでアポトーシス細胞を検出します。キットには、40サンプルの免疫蛍光染色に十分な試薬に加え、ApopTagポジティブコントロールスライドが含まれています。結果は、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を用いて分析します。

ApopTagフルオレセインIn Situアポトーシス検出キットは、以下のモデル系で特異的染色についてテストされています。（a）サイトスピンで染色した、デキサメタゾンで誘導したヒト正常末梢血リンパ球、（b）ホルマリン固定パラフィン包埋切片で染色した、ラット退縮乳腺、（c）細胞懸濁液で染色し定量的フローサイトメトリーに使用した、カンプトテシンで誘導したヒト白血病末梢血リンパ球。

ApopTag PlusフルオレセインIn Situアポトーシス検出キットは、フルオレセインレポーター分子にコンジュゲートさせた抗ジゴキシゲニン抗体を用いた間接TUNEL法により、in situでアポトーシス細胞を検出します。

はじめに

ApopTag In Situアポトーシス検出キットは、ゲノムDNAを修飾することで、研究サンプル中のアポトーシス細胞を標識します。特異的染色によるポジティブ細胞の検出のために末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）を使用します。本マニュアルには、ApopTag PlusフルオレセインIn Situアポトーシス検出キット（カタログ番号：S7111）に関する情報とプロトコルが記載されています。

手順の原則

すべてのApopTagキットで提供される試薬は、in situで、遊離3′OH DNA末端を、化学的に標識されたおよび標識されていないヌクレオチドで標識するようにデザインされています。反応バッファーに含まれるヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）によって酵素的にDNAに付加されます（13, 31）。TdTは、鋳型に依存しない、二本鎖または一本鎖DNAの3′-OH末端へのヌクレオチド三リン酸の付加を触媒します。組み込まれたヌクレオチドは、ランダムな配列のジゴキシゲニンヌクレオチドと非標識ヌクレオチドからなるオリゴマーを形成します。ApopTagキットにおける標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドの比は、抗ジゴキシゲニン抗体結合を促進するため、またはフルオレセインの自己消光を最小限に抑えるために最適化されています。追加されるオリゴマーの正確な長さは測定されていません。

ジゴキシゲニンヌクレオチドで標識されたDNA断片は、その後、フルオレセインとコンジュゲートさせた抗ジゴキシゲニン抗体と結合させます（図1A）。蛍光抗体は、免疫組織染色または免疫細胞染色（すなわち組織または細胞）で感度の高い検出を行うことができ、基質または発色段階による実験的な変動の影響を受けません。この混合分子生物学的-組織化学的システムにより、アポトーシス小体に局在する非常に高濃度の3′-OH末端を、高感度かつ特異的に染色することができます。

ApopTagシステムは、細胞内ビオチンへのアビジンの結合がエラーの原因となることがあった、これまでに報告されているアポトーシスのin situ標識技術（13, 16, 38, 46）とは大きく異なります。ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンシステムは、アビジン／ビオチンシステムと同等な感度を持つことが明らかにされています（22）。抗ジゴキシゲニン抗体の結合に関して免疫化学的に類似したリガンドは、動物組織では一般に重要ではないため、バックグラウンド染色が低いことが保証されます。アフィニティー精製ヒツジポリクローナル抗体は、ApopTagキットで使用される特異的抗ジゴキシゲニン試薬であり、主要な脊椎動物ステロイドとの交差反応性は<1%です。また、細胞内Fc受容体への非特異的吸着をなくすため、この抗体のFc部分はタンパク質分解消化によって除去されています。

1.最初に使用するまでは、キットを－15℃～－25℃で保存してください。 最初に使用した後、キットを3カ月以内に使用する場合は、TdT酵素（#90418）は－15℃～－25℃で保存し、その他の構成要素は2℃～8℃で保存してください。

2.抗ジゴキシゲニンフルオレセイン抗体（#90426）は、不必要な光ばく露から保護してください。

使用上の注意

1.以下のキット構成要素には、バッファーとしてカコジル酸カリウム（ジメチルアルシン酸）が含まれています：平衡バッファー（#90416）、反応バッファー（#90417）、TdT酵素（#90418）。これらの構成要素は飲み込むと有害です。皮膚と眼への接触を避け（手袋、眼鏡を着用）、接触した部位はすぐに洗ってください。

2.抗体コンジュゲート（#90426）およびブロッキング溶液（#90425）には、保存剤として0.08%アジ化ナトリウムが含まれています。

3.TdT酵素（#90418）にはグリセロールが含まれており、－20℃では凍りません。有効期間を最長にするため、分注する前にこの試薬が室温まで温まらないようにしてください。

平衡バッファー 90416 3.0 mL －15℃～－25℃

反応バッファー 90417 2.0 mL －15℃～－25℃

TdT酵素 90418 0.64 mL －15℃～－25℃

停止／洗浄バッファー 90419 20 mL －15℃～－25℃

ブロッキング溶液 90425 2.6 mL －15℃～－25℃

抗ジゴキシゲニン-フルオレセイン* 90426 2.1 mL 2℃～8℃

プラスチックカバースリップ 90421 100 ea.室温。

コントロールスライド 90422 2 ea.室温。

*アフィニティ精製ヒツジポリクローナル抗体

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

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