細胞生存率および増殖アッセイ
セクションの概要
はじめに
細胞増殖、細胞生存率、および細胞毒性を測定するアッセイは、様々な刺激による処理後の培養細胞の反応や健康状態をモニタリングするために一般的に用いられています。適切なアッセイ法の選択は、使用する細胞の数や種類、および期待される結果によって異なります。細胞増殖アッセイでは、経時的な細胞数の変化、細胞分裂回数、代謝活性、あるいはDNA合成をモニタリングすることができます。 トリパンブルーやカルセイン-AMなどの生存染色剤を用いた細胞計数は、増殖率と生存細胞の割合の両方を提供することができます。
細胞生存率および増殖アッセイの概要
図1.A、BrdU染色を用いたE4期ニワトリ胚の眼における増殖細胞 B、カンプトテシンを用いた抗BrdU抗体の検証。細胞周期停止剤であるカンプトテシンでJurkat細胞を処理することにより、増殖中の細胞がG1/S期移行点で捕捉される。
EdU増殖アッセイ
Baseclick EdU増殖アッセイは、複製中のDNAを蛍光検出するための効率的な手法を提供します。修飾ヌクレオシドであるEdUを生細胞に添加すると、複製中のDNAに取り込まれます。銅（Cu）を触媒とするクリック化学により、蛍光プローブをEdUに迅速に結合させることができます。これにより、増殖中の細胞を定量的にモニタリングすることが可能になります。 本アッセイは、顕微鏡イメージング、フローサイトメトリー、ハイスループットスクリーニング、および生体内実験向けに、さまざまなフォーマットで提供されています。励起ピークが488、555、594、および647の4種類の蛍光プローブが用意されており、他の蛍光プローブとの多重検出が可能です。
図2。Edu-Click細胞増殖キットは、活発なDNA合成の過程でEdU（5-エチニル-2'-デオキシウリジン）をDNAに取り込み、クリック化学に基づく蛍光検出法を用いて測定を行います。
代謝増殖アッセイ
代謝活性を測定するアッセイは、増殖、生存率、および細胞毒性の解析に適しています。MTT、XTT、WST-1などのテトラゾリウム塩が着色したフォルマザン化合物へと還元される反応、あるいはレサズリンの生体還元は、代謝が活発な細胞においてのみ起こります。活発に増殖している細胞は代謝活性を高めますが、毒素に曝露された細胞ではその活性が低下します。
MTT細胞増殖アッセイ
MTT（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾリルブルー）は、フェノールレッドを含まない培地や塩溶液中で調製すると黄色がかった溶液となる水溶性テトラゾリウム塩です。 溶解したMTTは、デヒドロゲナーゼ酵素によるテトラゾリウム環の切断を経て、不溶性の紫色のフォルマザンへと変換される。この水不溶性のフォルマザンは、イソプロパノールやその他の溶媒を用いて可溶化することができ、溶解した物質は、変換された色素の濃度に対する吸光度を測定することで分光光度法により定量される。
XTT細胞増殖アッセイ
MTTとは対照的に、XTTの分解生成物は水に溶解するため、可溶化工程は不要である。テトラゾリウム塩であるXTTは、複雑な細胞内メカニズムによってフォルマザンに分解される。この生体還元反応は生存細胞でのみ起こり、解糖系を介したNAD(P)Hの生成に関連している。生成されるフォルマザン色素の量は、培養中の代謝活性を持つ細胞の数と直接相関する。
WST-1 細胞増殖アッセイ
安定なテトラゾリウム塩であるWST-1は、主に細胞表面で起こる複雑な細胞内メカニズムによって、水溶性のフォルマザンに分解されます。この生体還元反応は、生存細胞における解糖系によるNAD(P)Hの生成に大きく依存しています。生成されるフォルマザン色素の量は、培養液中の代謝活性を持つ細胞の数と直接相関します。
プロトコルガイド：細胞生存率および増殖のためのWST-1アッセイ。プロトコル、FAQ、トラブルシューティング
図3。MTTアッセイは、代謝活性を基に細胞増殖を評価するための比色法である。 NAD(P)H依存性の細胞内酸化還元酵素は、生存している細胞の数を反映します。これらの酵素は、黄色のテトラゾリウム色素であるMTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を、紫色を呈する不溶性のフォルマザンへと還元する能力を持っています。
発光式細胞生存率アッセイ
ATPは代謝活性のある細胞の指標であるため、利用可能なATPの量に基づいて生存細胞数を評価することができます。「ATP細胞生存率ルシフェラーゼアッセイ」は、細胞培養中のATPを定量するための高感度のホモジニアスアッセイです。本キットは、ホタルルシフェラーゼを用いてD-ルシフェリンを酸化させ、その際に発生する発光を利用して、細胞培養中の利用可能なATP量を評価します。 この高感度なアッセイ手順では、血清添加培地で培養された細胞に、ATP検出カクテルを1回添加するだけで済みます。 細胞の洗浄、培地の除去、あるいは繰り返しのピペッティングは不要です。本キットは、単一の細胞または0.01ピコモルのATPを検出できるほど高感度です。生成されるシグナルは、6桁の範囲で直線性を示します。ATPの量を生存細胞数に関連付けることで、本アッセイは生存細胞数の測定から細胞増殖、細胞毒性の評価に至るまで、幅広い用途に活用できます。
図4。生物発光ATPルシフェラーゼ細胞生存率アッセイ。ホタルルシフェラーゼがATPを利用してD-ルシフェリンを酸化し、その結果として発光が生じることを利用して、細胞数や生存率と相関する利用可能なATPの量を評価する。
蛍光色素増殖アッセイ
CFSE標識
5(6)-カルボキシフルオレセインジアセテートN-サクシニミジルエステル（CFSE）は、細胞集団が経た分裂回数を測定するために広く用いられている。 細胞内に取り込まれると、CFSEは細胞内エステラーゼによって加水分解され、蛍光化合物が生成されます。また、スクシンイミジルエステル基は細胞内タンパク質の第一級アミンと共有結合を形成します。細胞分裂が起こると、各娘細胞の蛍光強度は半分になるため、フローサイトメトリーを用いて細胞分裂回数を簡単に検出することができます。CFSEは、T細胞を含むリンパ球の増殖を測定するために広く使用されています。
生細胞／死細胞の二重染色
生細胞／死細胞の二重染色は、生存細胞と死細胞の蛍光を同時に検出するために利用できます。カルセイン-AMは、親油性が高く、細胞膜透過性を持つ色素です。 カルセイン-AM自体は蛍光分子ではありませんが、生存細胞内のエステラーゼによってカルセイン-AMから生成されたカルセインは、強い緑色蛍光（λex 490 nm、λem 515 nm）を発します。したがって、カルセイン-AMは生存細胞のみを染色します。対照的に、核染色試薬であるプロピジウムヨウ素は、生存細胞の細胞膜を通過することができません。 プロピジウムヨウ素は、死細胞の細胞膜の不規則な領域を通過して核に到達し、DNAの二重らせんに挿入されて赤色の蛍光（λex 535 nm、λem 617 nm）を発する。カルセインとPI-DNAはいずれも490 nmの光で励起できるため、単一励起の蛍光顕微鏡を用いて、生存細胞と死細胞を同時に観察することが可能である。
図5。生細胞・死細胞の二重染色
3D細胞培養 - 生存細胞・死細胞・全細胞の3色染色
「細胞生存率イメージングキット」は、2Dおよび3D細胞培養において、生存細胞（カルセイン-AM）、死細胞（プロピジウムヨウ化物/PI）、および全細胞（ヘックスト33342）の蛍光染色を同時に行うことができる3色アッセイキットです。
- カルセイン-AMは、カルシウムと結合すると緑色に蛍光を発しますが、これは代謝が活発な生存細胞にのみ存在するエステラーゼ活性に依存しています。
- プロピジウムヨウ化物（PI）は核染色剤であり、生細胞の膜では排除されますが、死細胞の損傷した膜を通過してDNAに挿入され、強い赤色の蛍光を発します。
- Hoechst 33342は、細胞毒性が低いDNA染色剤です。青色に蛍光を発し、総細胞数の指標として使用されます。
トリパンブルーによる細胞計数
トリパンブルーは、生存細胞数を測定するための色素排除法において推奨される数ある染色剤の一つです。この方法は、生存している（生存可能な）細胞は青色の色素を取り込まないのに対し、死んだ（非生存）細胞は取り込むという原理に基づいています。細胞の生存率は、生存細胞数／総細胞数（生存細胞と死細胞の合計）の比率を用いて算出できます。また、染色を行うことで、細胞の全体的な形態を視覚的に確認しやすくなります。
注：トリパンブルーは、細胞タンパク質よりも血清タンパク質に対して強い親和性を示します。マトリックス中の血清の存在により背景が暗くなりすぎる場合は、計数前に細胞を遠心分離して沈殿させ、タンパク質を含まない培地または塩溶液に再懸濁する必要があります。
