정량적 PCR 기초

정량적 PCR(공식 명칭: 정량적 실시간 PCR, qPCR) 검출법은 기본적인 PCR 기술을 기반으로 하며, 연구자들이 시료 내 시작 물질의 양을 추정할 수 있게 합니다. 반응 진행 중 생성물을 검출하기 때문에 qPCR은 기존의 종점 PCR보다 훨씬 넓은 동적 분석 범위를 가집니다. 단일 복제본부터 약1011개 복제본까지 단일 실행 내에서 검출이 가능합니다. 정량 실시간 PCR 및 후속 증폭산물 검출은 밀폐된 튜브 형식으로 수행되어 겔 전기영동과 같은 PCR 후 조작이 필요 없으며 교차 오염 위험을 크게 줄입니다.

이 페이지에서는 qPCR의 기본 원리를 다루며, 일반적인 검출 화학 기법의 메커니즘은 '정량적 PCR 및 디지털 PCR 검출 방법'에서 설명합니다.

기본 원리

qPCR 수행 시, 형광 리포터 염료는 각 증폭 주기 동안 존재하는 핵산 양을 간접적으로 측정하는 데 사용됩니다. 형광 신호의 증가는 반응의 반복 단계( 폴리머레이스 연쇄 반응 참조) 동안 지수적으로 축적되는 PCR 산물 분자(증폭산물)의 양에 정비례합니다. 리포터 분자는 다음과 같이 분류됩니다: 이중가닥 DNA(dsDNA) 결합 염료, 프라이머에 접합된 염료, 또는 추가적인 염료 접합 올리고뉴클레오티드(프로브라고 함)(정량적 PCR 및 디지털 PCR 검출 방법 참조).

SYBR^® Green I과 같은 이중가닥 DNA 결합 염료의 사용은 가장 단순한 형태의 검출 화학 반응을 나타냅니다. 용액 내에서 자유 상태이거나 단일가닥 DNA(ssDNA)만 존재할 때 SYBR Green I 염료는 낮은 신호 강도로 빛을 방출합니다. PCR이 진행되고 이중가닥 DNA의 양이 증가함에 따라 더 많은 염료가 증폭산물에 결합하여 신호 강도가 증가합니다.

대안으로, 프로브(또는 검출 화학에 따라 두 개의 조합)는 프라이머 사이에 위치한 템플릿의 특정 영역에 결합함으로써 이중가닥 DNA 결합 염료 이상의 검출 특이성을 추가할 수 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 프로브 형식은 이중표지 프로브(DLP; 가수분해 또는Taq Man^® 프로브라고도 함)입니다. DLP는 5’ 말단에 형광 표지(예: 6-FAM^™)와 3’ 말단에 소광 분자(예:BHQ^®1또는 OQ^™와 같은 다크 소광제)를 가진 올리고뉴클레오티드입니다(정량적 PCR 및 디지털 PCR 검출 방법 참조). 이러한 프로브는 두 프라이머 사이의 템플릿에 하이브리드화되도록 설계되었으며, 고유한 5’→3’ 엑소뉴클레이스 활성을 지닌 DNA 중합효소와 함께 사용됩니다. DLP가 용액 내에서 자유로운 상태일 때는, 리포터 염료가 소광기 부분과 매우 근접해 있기 때문에 신호 강도가 낮습니다. 반응 중 더 많은 템플릿이 생성됨에 따라 더 많은 프로브가 템플릿에 하이브리드화되고, 이는 진행 중인 DNA 중합효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단됩니다. 5' 리포터 염료가 용액으로 방출됨에 따라 형광 신호 강도가 증가합니다. 서로 다른 리포터 염료로 표지된 프로브를 사용하면 단일(멀티플렉스) 반응에서 여러 표적을 동시에 검출 및 정량할 수 있습니다.

전형적인 qPCR 실행은 교대 온도 배양의 반복 사이클로 구성됩니다(사이클링 절차 3.1). 이 프로파일은 qPCR에서 이중가닥 DNA 결합 염료, 분자 비콘 또는스콜피온^® 프로브가 검출 화학물질로 선택될 때 자주 사용됩니다. 프라이머 연장은 대부분의 DNA 중합효소의 진행성(processivity)에 최적의 온도인 72°C에서 가장 효율적입니다. 72°C에서는 초당 약 100 염기 속도로 중합이 발생합니다. 그러나 더 낮은 온도에서도 짧은 템플릿을 증폭하기에 충분한 진행성이 유지됩니다. qPCR 증폭산물은 일반적으로 기존 PCR 산물보다 짧습니다(200 염기 미만). 따라서 이중 표지 프로브를 사용할 때는 60°C에서 연장 및 어닐링을 단일 단계로 결합하는 경우가 많습니다(사이클링 절차 3.2).

사이클링 절차 3.1

dsDNA 결합 염료, 분자 비콘 또는스콜피온스^® 프로브 검출을 사용하는 표준 qPCR 프로파일의 예시.

• 초기 변성: 반응 온도를95°C로 올리고 시료를 2~10분간(시간은 중합효소 핫 스타트 메커니즘에 따라 다름) 인큐베이션하여 모든 복합 표적(dsDNA)이 분리되고 단일 가닥으로 변환되어 증폭 가능하도록 합니다.
  
  
• 사이클링:
  1. 변성: 반응 온도를 95°C로 10초간 올려 모든 dsDNA를 용해시킵니다.
     
  2. 애닐링: 온도를 60°C로 낮추어 30초 동안 유지하여 프라이머 및 프로브(포함된 경우)가 템플릿에 결합하도록 촉진합니다.
  3. 연장: 이후 연장은 TaqDNA 중합효소의 처리 효율에 최적화된 72°C의 상승된 온도에서 발생합니다. 연장 시간은 증폭 산물 크기(1kb당 30초)에 따라 달라집니다. 연장의 기간은 원하는 증폭 산물의 길이와 사용된 효소에 따라 달라집니다. qPCR 증폭 산물은 짧기 때문에 일반적으로 5~30초입니다.

• 반복: 단계1~3을 일반적으로 40회 반복합니다.

사이클링 절차 3.2

DLP 검출을 위한 2단계 사이클링 qPCR 프로파일 예시.

• 초기 변성: 온도를95°C로 올리고 반응을 2~10분 동안 인큐베이션합니다(폴리머라제 효소의 핫 스타트 특성에 따라 다름).
  
  
• 사이클링:
  1. 변성: 반응 온도를 95°C로 10초간 상승시켜 모든 이중가닥 DNA(dsDNA)를 용해시킵니다.
  2. 결합 및 연장: 온도를 60°C로 낮추어 30초 동안 유지하여 프라이머가 템플릿에 결합하도록 촉진하고, 이 온도에서 DNA 중합효소의 충분한 활성으로 인해 후속 연장이 발생합니다.
     

• 반복: 1~2단계를 일반적으로 40회 반복한다.
  반응 과정에서의 형광 변화는 실시간 PCR 열순환기에 의해 측정됩니다. 전용 실시간 PCR 장비는 온도 순환 기능과 광학 장치를 결합합니다. 광학 장치는 형광체를 여기시키기에 적합한 파장의 빛을 제공하며, 그 결과 발생하는 형광을 감지합니다. 많은 현대식 장비에는 부착된 디스플레이 화면이나 근처 컴퓨터 모니터가 있어 반응 진행 상황을 실시간으로 추적할 수 있습니다(그림 3.1).

gDNA 표적의 정량화 및 분석

정량적 실시간 PCR은 gDNA 표적 분석에 쉽게 적용될 수 있다. 이러한 연구는 유전자형 분석/SNP
결정, 메틸화 분석, 트랜스제닉 서열 스크리닝, 또는 삽입 및 결실 모니터링을 포함할 수 있습니다.

mRNA 전사체의 정량화 및 분석

qPCR의 일반적인 응용 분야는 유전자 발현 분석입니다. 예를 들어, 대조군과 처리군 샘플 간 관심 유전자의 mRNA 농도를 비교하는 것입니다. mRNA는 2단계 또는 1단계 RT-qPCR 과정을 통해 정량화할 수 있습니다(RT 반응에 대한 자세한 내용은 역전사 정량 실시간 PCR 참조).

2단계 RT-qPCR

역전사 및 qPCR 반응은 별도의 튜브에서 순차적으로 수행됩니다. 총 RNA 또는
폴리(A)+ RNA를 시작 물질로 사용하며, 올리고-dT 프라이머,
이 반응의 일부를 qPCR에 첨가합니다.

원스텝 RT-qPCR

역전사 및 qPCR 반응을 하나의 튜브에 결합하면 실험 설정이 단순화되며
시료의 추가 취급이 필요하지 않아 오염 가능성이 낮아집니다.

ncRNA 전사체의 정량 및 분석

대부분의 비코딩 RNA는 100개 이상의 뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, mRNA 분석에 사용되는 것과 동일한 기법을 사용하여 RT-qPCR로 검출 및 정량할 수 있습니다.
mRNA 분석에 사용되는 동일한 기법으로 검출 및 정량화할 수 있습니다. 반면 마이크로 RNA 및 피위 RNA와 같은 짧은 비코딩 RNA는 기본적으로 단일 PCR 프라이머 길이입니다. 따라서 qPCR 수행 전에 이러한 짧은 RNA를 연장하는 기법이 필요합니다. 상용 시스템에서는 주로 두 가지 접근법이 채택됩니다: 1) 스템루프 RT 프라이머 사용, 2) 폴리-A 꼬리 부착 후 올리고-dT 어댑터 프라이머를 이용한 RT 수행(그림 3.2). Casoldi 등이 개발한 상용화되지 않은 대체 접근법은 시료 내 모든 RNA에 어댑터 분자를 연결하고, 원하는표적 간 구분을 위한 특이적 프라이머 설계를활용합니다1,2.

스템루프 RT 프라이머 방식은 Applied Biosystems(현 Life Technologies/Thermo)에서 개발 및 상용화되어 후속 TaqMan 프로브 기반qPCR에 활용되었다³⁾. 그림 3.2A에서 보듯, RT 프라이머의 5'-말단은 자체 3'-말단에서 몇 뉴클레오티드 떨어진 영역과 염기쌍을 형성하여, 염기쌍이 형성된 스템과 염기쌍이 형성되지 않은 루프로 분리된 구조를 생성한다. RT 프라이머의 3'-말단에서 마지막 몇 뉴클레오티드를 제외한 모든 부분은 보편적입니다. 즉, 모든 miRNA 프라이머에서 동일한 서열을 포함합니다. 스템에서 3' 방향으로 연장된 마지막 몇 뉴클레오티드는 표적 miRNA의 3'-말단과 상보적입니다. 프라이머가 miRNA 템플릿을 따라 연장되면
cDNA를 생성하며, 이는 miRNA 특이적 포워드 프라이머와 보편적 리버스 프라이머로 증폭될 수 있습니다. 후자는
스템-루프 RT 프라이머의 5'-말단과 상보적이다.

당사Mysti Cq^® 브랜드를 포함한 다른 모든 상용 miRNA qPCR 방법은Shi와 Chiang4가 기술한 바와 같이 폴리-A 테일링을 사용하여 miRNA를 연장합니다. 템플릿 독립형 효소인 폴리(A) 중합효소(PAP)는 ATP의 아데노신 잔기를 모든 RNA의 3'-말단으로 전이시키는 반응을 촉매합니다. 그림 3.2B에 설명된 바와 같이, 올리고-dT 프라이머를 사용하여 RT를 수행할 수 있습니다. 올리고-dT 프라이머는 5'-말단에 어댑터 서열을 포함하고 있어, 특정 miRNA에 상보적인 포워드 프라이머와 어댑터 서열에 상보적인 리버스 프라이머를 사용하여 후속 qPCR을 수행할 수 있게 합니다.

상업적 접근법은 각각 장단점이 있습니다. 스템-루프 프라이밍은 2단계 RT-qPCR을 가능하게 하는 반면, 대부분의 폴리-A 테일링 방법은 qPCR 전에 RT를 위한 추가 단계를 필요로 합니다. 폴리-A 테일링과 RT를 단일 반응으로 결합하여 2단계 PAP 테일링/RT-qPCR을 수행하는 제품도 있습니다. 그러나 이 접근법은 검출 감도가 낮을 수 있습니다(미발표 내부 결과). 반대로, 폴리-A 테일링 후 RT를 수행하면 안정적인 cDNA 풀이 생성되어 즉시 또는 향후 언제든지 모든 마이크로RNA, mRNA 또는 기타 RNA를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 스템-루프/TaqMan 접근법의 경우, 각 miRNA 검출마다 다른 프라이머가 필요합니다. 동일한RT 반응에 여러 스템-루프 프라이머를 추가할 수있으며5, Life Technologies에서 다중 miRNA용 RT 프라이머 풀을 구입하여 다중 RT를 수행할 수 있습니다. 그러나 두 방법 모두 추후 발견된 miRNA의 qPCR 검출은 불가능하며, 동일한 cDNA로부터 mRNA를 qPCR로 검출하는 것도 허용하지 않습니다. Castoldi등1,2이 기술한 시스템은 동일한 총 RNA 샘플로부터 mRNA, 전구체 및 완전히 처리된 miRNA 분자를 검출할 수 있는 수단을 제공한다는 점에서 독특합니다.

qPCR 요구 사항

기기

많은 qPCR 기기는 특정 범위의 응용을 지원하도록 설계되었습니다. 예를 들어, 384-웰 플레이트의 자동 로딩 기능을 사용하는 ABi 7900 고속 처리 기기와 단일 48-웰 플레이트를 지원하는 Illumina에서 생산 및 판매하는 Eco 기기의 기능을 비교해 보십시오. 따라서 연구 요구사항에 가장 적합한 장비를 선택해야 합니다. 사용자가 원하는 기능을 수행하고 데이터 출력 측면에서 유연성을 갖춰 하류 통계 분석 소프트웨어 패키지에서 쉽게 조작할 수 있는 사용자 친화적 소프트웨어를 갖춘 장비를 선택하는 것이 바람직합니다. 이는 인력 교육에 소요되는 시간을 줄여 결과 생성 시작 시점을 앞당깁니다. 추가적으로 요구되는 기능으로는 절대적으로 균일한 PCR 블록(96개의 중복 웰 전체에서 최대 편차 1_Cq = 2배 이내)과 광범위한 파장 범위에서 가능한 한 민감하고 균일하게 발광을 여기 및 검출하는 광학 시스템이 포함됩니다. 이는 다양한 형광체 선택을 허용하고 다중 검출(멀티플렉싱)을 가능하게 합니다. 고려해야 할 다른 특징으로는 특정 소모품과 관련된 운영 비용(예: 표준 마이크로타이터 플레이트를 반응에 사용하지 않는 경우) 및 비표준 형식의 플레이트/튜브 로딩 편의성 등이 있습니다.

템플릿

qPCR을 시작하기 위해서는 표적 핵산의 극소량 복제본(gDNA 또는 cDNA 약 100 pg에 해당)만 필요합니다. 반응 억제제 오염을 최소화하기 위해, 정확한 정량화를 달성하는 데 필요한 최소한의 시작 템플릿 양을 유지해야 합니다. 시작 물질이 RNA인 경우, 프라이머 설계와 DNase I 처리는 gDNA 오염으로 인해 발생할 수 있는 신호를 줄일 수 있습니다.

프라이머

dsDNA 결합 염료 또는 프로브 기반 검출 화학법을 사용하든, 고품질 프라이머 설계는 qPCR에서 가장 중요한 실험 전 단계 중 하나입니다. 검출법 설계에 대한 자세한 논의는 PCR, qPCR, dPCR 검출법 설계를 참조하십시오. 민감도와 특이도를 극대화하기 위해, 락드 뉴클레오티드(LNA)와 같은 필요한 수정 사항을 포함해야 합니다(qPCR 검출 화학법).

프로브

증폭산물 검출 메커니즘으로 프로브를 사용할 경우, 프라이머 다이머 및 비특이적 생성물은 검출되지 않지만 반응 효율을 저하시킬 수 있으므로 피해야 합니다. 민감도와 특이성을 극대화하기 위해, 해당 응용 분야에 적합한 프로브 유형을 선택하고 락드 뉴클레오티드(LNA)와 같은 필요한 수정 사항을 포함해야 합니다(qPCR 검출 화학).

dNTPs

표준 PCR 및 qPCR 마스터 믹스에는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함됩니다. 그러나 일부 믹스는 dTTP를 dUTP로 대체한 제품도 있습니다. dUTP로 수행된 이전 반응의 산물에는 티민 대신 우라실이 포함됩니다. 이러한 산물은 우라실-DNA-글리코실레이스(UNG)에 의해 절단될 수 있습니다. 따라서 후속 반응을 UNG와 함께 사전 배양하면 반응 간 잔류 오염을 방지할 수 있습니다. 효과를 보장하려면 실험실 내 모든 PCR에 dUTP를 사용해야 합니다.

마그네슘

염화 마그네슘(_MgCl₂)은 역전사효소, Taq DNA 중합효소 및 Taq DNA 5'-3' 엑소뉴클레이아제 활성에 필수적입니다. DLP를 포함하는 반응의 최적Mg²⁺ 농도는 일반적으로 3~6 mM 사이입니다. 대부분의 마스터 믹스에는_MgCl2가 포함되어 있지만, 때로는 농도를 최적화해야 할 필요가 있으므로, 일반적으로 마스터 믹스 제품에 순수_MgCl2가 추가 튜브로 포함됩니다( 분석법 최적화 및 검증 참조).Scorpions^® Probe 검출을 사용하는 경우와 같이 낮은 농도를 사용할 수 있도록_MgCl2를 포함하지 않는 반응 혼합물이 필요한 경우도 있습니다.

역전사 효소

RT-qPCR의 성공에는 고온에서도 활성을 유지하면서 높은 수율의 cDNA를 생성하는 역전사효소가 핵심적입니다. 고온에서의 성능은 RNA의 2차 구조가 복잡한 영역을 불안정화시켜 하이브리드화 및 후속 증폭에 접근 가능하게 합니다. 원스텝 RT-qPCR 수행 시 고온 성능은 높은 용융점(_Tm)을 가진 유전자 특이적 프라이머 사용을 가능하게 하여 반응 특이성을 높입니다. 2단계 프로토콜을 수행할 때는 효소가 RNA로부터 cDNA를 선형적이고 비례적으로 생산하도록 보장하는 것이 중요합니다(RT 평가에 대한 자세한 내용은 역전사 참조).

Taq DNA 중합효소

RT에 가장 적합한 역전사효소를 선택하는 것과 마찬가지로, 적절한 중합효소 선택도 매우 중요합니다. 천연 Taq DNA 중합효소의 근본적인 문제점은 저온에서 잔류 활성을 보인다는 것입니다. 이 잔류 중합효소 활성으로 인해 비특이적 프라이머 결합이 발생하고, 결과적으로 비특이적 산물이 생성됩니다. 항체 차단 또는 화학적 차단 방식의 Taq DNA 중합효소('핫 스타트')는 고온 변성 단계가 시작될 때까지 효소 활성을 억제함으로써 이러한 문제를 해결합니다.

버퍼

완충액 또는 반응 마스터 믹스는 일반적으로 dNTP, Taq DNA 중합효소,_MgCl2 및 안정제를 포함합니다. 검출 화학, 장비 및 반응 요구 사항에 따라 SYBR Green I 염료, ROX^™, 플루오레신 및 불활성 로딩 염료(로딩 제어 염료)도 포함될 수 있습니다. PCR 버퍼 성분과 안정제는 일반적으로 제조업체의 독점 기술입니다. 별도로 구매할 경우 각 성분을 반응에서 개별적으로 최적화할 수 있어 최대의 유연성을 확보할 수 있습니다. 반면, 마스터 믹스로 성분을 함께 구매하면 유연성은 줄어들지만 배치 일관성과 편의성이 향상되며, 피펫팅 단계가 감소하여 오류 및 오염 가능성도 줄어듭니다.

로딩 제어 염료

일부 실시간 PCR 열순환기는 광학 시스템의 변동성을 제어하고 신호 강도 차이를 정규화하기 위해 각 반응에 ROX와 같은 로딩 염료를 포함해야 합니다. 마찬가지로, 일부 열순환기는 SYBR Green I 염료 분석법(배경이 매우 낮은)을 사용할 때 가상 배경을 생성하기 위해 초기 플루오레세인 신호를 요구합니다. 이러한 염료는 마스터 믹스에 포함되거나 별도 성분으로 제공되어 적절한 농도를 사용할 수 있습니다.

MIQE 가이드라인

qPCR 사용의 명백한 문제점 중 하나는 수치 결과를 쉽게 생성할 수 있으며, 이를 정량적 결과로 해석하기 쉽다는 점입니다. 그러나 이는 품질 관리 및 추가 분석이 필요할 수 있어 오해의 소지가 있습니다. 부적절한 분석 설계, 실행 또는 데이터 분석으로 인한 잠재적 인공물을 구분하기 위해서입니다. 충분한 품질 관리 없이 표면상 유의미한 데이터를 발표하는 것은 최악의 경우 부정확하고, 최선의 경우 생물학적 또는 임상적 관련성이 없는 보고서로 이어집니다.

qPCR 실험 과정의 각 단계, 즉 시료 획득부터 qPCR 데이터 분석에 이르기까지변동성에 취약하다⁶. 따라서 변동성은 시료 선택 및 처리, 핵산 추출(qPCR 표적 검출의 재현성 부족을 초래하는 품질 차이를 유발할 수 있음), 분석법 설계 및 최적화(분석법 효율성과 민감도 차이에 기여함), 데이터 분석(일부 주관적 해석과 적절한 통계 방법 적용이 필요함) 과정에서 발생할 수 있다. 과학적 독자에게 제공되는 정보는 실험을 비판적으로평가할 수 있도록 충분한 내용을 포함해야 합니다⁷. 그러나 항상 그런것은 아닌 것으로보입니다⁸. "정량적 실시간 PCR 실험 출판을 위한 최소 정보(MIQE)"지침⁹은 이러한 우려를 해결합니다. MIQE 가이드라인의 목적은 독자가 출판물의 기술적 타당성을 평가할 수 있도록 분석법에 관한 최소한의 정보를 명시함으로써 투명성을 높이고, 새로운 qPCR 분석법의 설계, 최적화 및 검증에 대한 지침을 제공하는 것입니다.

MIQE는 9개 섹션(실험 설계, 시료, 핵산, 역전사, 표적, 프라이머 및 프로브, 분석 세부사항, PCR 사이클링, 데이터 분석)으로 구성됩니다(체크리스트 다운로드: MIQE 페이지 참조, 표 1). 모든 매개변수는 실험 설계, 최적화 및 검증 과정에서 확보해야 할 정보와 관련됩니다. 상용 분석법이나 기존 문헌의 분석법을 사용할 경우에도 최적화와 검증은 반드시 수행해야 합니다. MIQE 논문에는 '필수(Essential)'로 분류된 요소들을 포함한 체크리스트가 포함되어 있으며, 이는 qPCR 분석법의 적절한 설명에 필수적인 요소로 간주됩니다. 반면 '권장(Desirable)'으로 분류된 다른 구성 요소들은 유용한 정보이지만, 이 정보가 없더라도 분석법을 재현하고 출판된 데이터를 평가할 수 있음을 나타냅니다. 각 개별 분석법의 PCR 효율성, 분석적 민감도 및 특이도를 보고하는 것이 필수적이며, 연구자가 실험실 조건을 사용하여 이를 결정해야 한다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 디지털 PCR 수행 시 고려해야 할 특정 사항( 디지털 PCR 참조)은 최근 디지털 PCR MIQE출판물10에서 다루어졌습니다.

MIQE 기준을 준수하고 있습니까?

정량적 실시간 PCR 실험 출판을 위한 최소 정보 기준