MTT細胞増殖アッセイキット

MTTは淡黄色の基質であり、生細胞によって切断されて濃青色のホルマザン生成物を形成します。このプロセスには活性なミトコンドリアが必要であり、死んだ直後の細胞であっても大量のMTTは切断できません。以下に示した比色分析アッセイは、増殖アッセイまたは補体依存性細胞傷害アッセイに使用できます。

手順：
1）光学的品質が良好な96-ウェル平底組織培養プレート（例、Falcon）で、標準法を用いて、リンホカイン、マイトジェン、または補体依存性細胞傷害アッセイを行います。各ウェルの組織培地の最終容量は0.1 mLとし、培地（例、RPMIまたはDMEM）に含まれるウシ胎児血清は最高10%とします。

2） アッセイ終了時に、各ウェルに0.01 mLのAB溶液（MTT）を加えます。トレイの側面をくたたいて混ぜます。

3） 37°Cでインキュベートし、 MTTを切断させます。最適時間はアッセイによって異なりますが、ほとんどの目的には4時間が適しています。インキュベート時間の終了時には、生細胞を含むウェル内で生成されたMTTホルマザンが、ウェルの底に黒い針状結晶として現れます。

4） 0.04 N HCl入りイソプロパノールを各ウェルに0.1 mL加えます。マルチチャンネルピペッターでピペッティングを繰り返し、完全に混合します。HClは、組織培地中のフェノールレッドを、MTTホルマザンの測定を妨げない黄色に変えます。イソプロパノールはホルマザンを溶解し、吸光度測定に適した均一な青色の溶液にします。

5）１時間以内に、ELISAプレートリーダーで試験波長570 nm、参照波長630 nmで吸光度を測定します。室温で数時間放置すると、酸／アルコールにより血清タンパク質が沈殿し始める場合があります。プレートを冷やすと沈殿が促進されます。測定前にプレートを保管する必要がある場合は、酸／アルコールを添加する前に4° Cに保ち、次に室温まで温めて、測定直前に酸／アルコールを添加してください。

結果：
MTTアッセイでは、通常、典型的な細胞株の200～50,000個の細胞が検出されますが、有効範囲は1,000～50,000個です。他の細胞タイプでは数が異なる場合があります。細胞傷害アッセイは、コントロールの非溶解細胞のシグナルが0.2～0.4となるよう設定する必要があり、増殖アッセイでは、プラトー濃度で同様の値が得られるようにする必要があります。これは、典型的な細胞株ではウェルあたり約20～50,000個の細胞に相当します。

吸光度は細胞数に正比例します。実際の細胞は、1 x 10⁶ cells/mLの濃度でもあまり吸収しません。

2～8°Cで最長6カ月間保存できます。試薬A / 溶液B混合物は、2～8°Cで最長2週間安定です。

試薬の調製：
10 mLの溶液Bを1バイアルの試薬Aに加えます。よく混合し、滅菌ろ過して、使用するまで4° Cで暗所で保存します。注記：溶解には一晩かかる場合があります。溶液を加熱しないでください。どうしても結晶を溶解する必要がある場合は、1～2滴のHClでpHを調整してください。この条件下では、AB混合物は数週間安定です。

試薬A： MTT, (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル テトラゾリウム ブロミド)、50 mg/バイアル。

溶液B： PBS pH 7.4、15 mL

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