ターミナルトランスフェラーゼ

ターミナル・トランスフェラーゼは、鋳型に依存しない、二本鎖、一本鎖DNAフラグメントおよびオリゴヌクレオチドの3′-OH末端へのデオキシおよびジデオキシヌクレオシド三りん酸の付加を触媒します。ターミナル・トランスフェラーゼは、ジゴキシゲニン、ビオチン、および蛍光色素で標識したデオキシ-およびジデオキシヌクレオシド三りん酸、放射性標識したデオキシ-およびジデオキシヌクレオシド三りん酸を組み込みます。供給される5倍濃縮反応緩衝液により、二本鎖DNAのすべてのタイプの末端：平滑末端、3′オーバーハングあり、5′オーバーハングありへの最適なテーリングが可能になります。組み込み速度は3′オーバーハングありで最大になります。

ターミナル・トランスフェラーゼを使用してヌクレオチドを二本鎖または一本鎖DNAフラグメントの3′-OH末端に付加する。例：

• dNTPによるテーリング：DNAフラグメントへのホモポリマー・テールの付加
• 放射性修飾または化学修飾されたヌクレオチド(例：DIG-dUTP)による二本鎖、一本鎖DNAおよびオリゴヌクレオチドの標識化

ddNTPによる3′-末端の標識化：
放射性修飾または化学修飾されたジデオキシヌクレオチド(例：DIG-ddUTP)による二本鎖、一本鎖DNAおよびオリゴヌクレオチドの標識化

ジゴキシゲニンで標識したジデオキシウリジン-三りん酸を1つ組み込み、ターミナル・トランスフェラーゼを使用してオリゴヌクレオチドの3′末端を酵素的に標識します。オリゴヌクレオチドを標識するもう1つの方法は、それより長いヌクレオチド・テールを付加することです。テーリングされたオリゴヌクレオチド・プローブの生成には、鋳型に依存しない反応にデオキシヌクレオチド三りん酸を使用します。

標識ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの組み込み
標準ヌクレオチドに加えて、ターミナル・トランスフェラーゼは放射性標識または修飾(例：ジゴキシゲニン、ビオチン、蛍光色素による標識)したdNTPまたはddNTPをDNAに付加します。

1キットに3構成要素が含まれています。

標準溶液: 放射性ヌクレオチドによる標準テーリング反応
CoCl₂標準溶液の調製
滅菌したバイアル中に2回蒸留(滅菌)水10 μlと供給される25 mM CoCl₂溶液15 μlを加えます。最終濃度：15 mM

放射性標識混合物の調製
dATPおよびdTTP標識混合物：2.5 mM dATPまたはdTTP溶液1体積を、2回蒸留(滅菌)水15体積およびα-³²P-dATPまたはα-³²P-dTTP (800 Ci/mmol、約30 TBq/mmol) 4体積と混合します。
dGTPおよびdCTP標識混合物：2 mM dGTPまたはdCTP溶液1体積を、2回蒸留(滅菌)水15体積およびα-³²P-dGTPまたはα-³²P-dCTP (800 Ci/mmol、約30 TBq/mmol) 4体積と混合します。

5′および3′エキソヌクレアーゼ活性、エンドヌクレアーゼ活性、およびニッキング活性がないことは、現行の品質管理手順に従って試験済みです。

1単位は、d(pT)₆をプライマーとして使用するアッセイ条件下、+37°Cで30分間以内に1 nMolのdTMPを酸不溶性生成物に組み込む酵素活性です。単位アッセイ条件：120 μl反応体積中に200 mMカコジル酸カリウム、1 mM CoCl₂、1 mM dTTP、0.1 OD d(pT)₆、6.25 pmol ³H dTTP。

単位アッセイ：単位アッセイ条件：120 μl反応体積中に200 mMカコジル酸カリウム、1 mM CoCl₂、1 mM dTTP、0.1 OD d(pT)₆、6.25 pmol ³H dTTP。

体積活性：400 U/μl

試料物質

• 二本鎖または一本鎖DNAフラグメント
• 二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチド

実験室での一般的用途向け。二本鎖DNAは平滑末端、3′-突出末端、または5′-突出末端のいずれかをもつ可能性があります。しかし、3′-突出末端は組み込み速度が最大となります。TdTは少なくとも3塩基から成るオリゴヌクレオチドをプライマーとして必要とし、一本鎖DNAの方が二本鎖DNAより効率的にテーリングされます。