mRNAワクチンおよび治療薬の製造戦略
開発から臨床試験までの期間が短縮されたmRNA技術は、感染症の流行に迅速かつ効果的に対応する手段としてだけでなく、アンメット・メディカル・ニーズ（未充足医療ニーズ）のある疾患に対処する新規治療薬の開発においても、大きな期待が寄せられています。mRNA技術には、優れた安全性プロファイル、高い汎用性、そしてテンプレートを用いた製造プロセスなど、多くの利点があります。
mRNAワクチンの初期の成功を受け、今日のmRNAメーカーは、mRNAの安定性を向上させ、pDNAおよびmRNAの精製を改善し、GMP生産へとスケールアップするための戦略を導入することで、製造プロセスの効率と生産性の向上を目指しています。
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セクション概要
mRNA製造における考慮事項
mRNAワクチンおよび治療薬の製造は、通常、テンプレート化されたプロセスに従って行われます（図1）。この簡略化された製造テンプレートでは、あらゆる標的に対して同一の反応材料を使用するため、mRNAメーカーはプロセスの調整を最小限に抑えつつ、新たな標的分子を製造することが可能となります。
図1.mRNA製造の一般的なプロセス概要。
最終的なmRNA製品のプロセス、収率、品質には、いくつかの重要な決定事項が極めて大きな影響を及ぼしますが、その一つがプロセス用化学薬品および原材料の品質です。特にインビトロ転写および下流工程の精製中は、mRNAは保護されておらず、酵素による分解のリスクが高くなります。エンドヌクレアーゼ活性がないことが確認された高品質な化学薬品を使用することで、RNaseによる分解のリスクを最小限に抑え、mRNA医薬品の精製および製剤化の全工程を通じてmRNAの安定性を向上させることができます。
本ウェブページでは、mRNA製造プロセスを効率化するために設計された、当社の包括的かつ統合的なソリューションに関する情報を提供し、これらの課題やその他の課題への対処を支援します。当社のパンフレット「mRNA医薬品製造用プロセス化学品」には、適切な選択を行うために必要な詳細情報が記載されています。
図2。mRNAの構造。
- 配列の5’末端にあるキャップ領域：mRNAの成熟、効率的なタンパク質翻訳のためのリボソームによる認識、および安定性向上のためのヌクレアーゼによる分解からの保護に不可欠である。
- mRNAコード領域の上流および下流領域にある非翻訳領域（UTR）：mRNAの翻訳、局在化、および安定性を調節し、タンパク質発現効率の向上に利用可能。
- オープンリーディングフレームまたはコード配列領域：目的遺伝子（GOI）を含む。
- ポリ（A）テール：3’末端エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐことで、タンパク質翻訳およびmRNAの安定性に不可欠である。
mRNAの作製
mRNAを基盤とする治療薬やワクチンの製造は、プラスミドDNA（pDNA）テンプレートから始まり、これを線状化した後、mRNAへと転写します。
- pDNAの製造：pDNAテンプレートには、DNA依存性RNAポリメラーゼのプロモーターおよびmRNA構築体の配列が含まれています。pDNAは細菌細胞内で増幅され、その後、細胞を回収して溶解し、環状のpDNAを放出させます。この溶解液は、pDNAに加え、RNA、ゲノムDNA、細菌細胞由来のエンドトキシンなどの大きな負電荷を持つ不純物を含んでいるため、極めて粘度が高く、精製が困難となります。
- pDNAの精製：不純物からpDNAテンプレートを精製する際は、分離効率を最大化しつつ、プラスミドテンプレートへの機械的損傷の可能性を最小限に抑える必要がある。 精製された環状pDNAは、その後、除去が必要となる望ましくないmRNA配列変異体を生成する可能性のある転写リードスルー現象を回避するために線状化される。1 この線状化されたpDNAテンプレートは、線状化に使用された制限酵素、ウシ血清アルブミン（BSA）、DNA断片、エンドトキシンなどの不純物を除去するためにさらに精製される。 pDNA テンプレートは通常、細菌細胞内で生産されるため、エンドトキシン不純物は、その後の精製工程に影響を与える重大な不純物となります。Deviron® C16 などの界面活性剤は、エンドトキシンを効果的に除去するために使用でき、従来の界面活性剤に代わる、持続可能で生分解性があり、REACH 規制に準拠した代替品です。2
実験室規模とGMP生産規模におけるpDNA精製のアプローチには顕著な違いがあります。実験室規模のプロセスでは、pDNAを他の成分から分離するために溶媒抽出法がしばしば用いられますが、大規模な環境下でのこれらの化学物質の取り扱いと廃棄は困難を伴う場合があります。対照的に、GMP生産環境では通常、不純物を効率的に除去するためにタンジェンシャルフローろ過（TFF）およびクロマトグラフィーが使用されます。
インビトロ転写（IVT）：直線化および精製されたpDNAは、酵素反応によりmRNAへと転写されます。
- インビトロ転写に不可欠な成分には、DNAからmRNAへの転写を触媒するRNAポリメラーゼ、mRNAの構成要素となるリボヌクレオシド三リン酸（rNTP）、mRNA収量を向上させる無機ピロホスファターゼ（IPP）、およびRNAの分解を防ぐRNase阻害剤が含まれます。 転写バッファーには通常、ジスルフィド結合を還元しRNase活性を阻害するジチオトレイトール（DTT）が含まれており、転写効率の向上と核酸の安定化のためにスペルミジンが添加されています。この重要な工程における酵素的分解のリスクを最小限に抑えるためには、エンドヌクレアーゼ活性がないことが確認された化学物質を選択することが不可欠です。 エンドヌクレアーゼフリー製品の幅広いラインナップを含む、当社の高品質な化学薬品および添加剤に関する包括的な概要については、パンフレット「mRNA医薬品製造用プロセス化学薬品」をご覧ください。
- 転写のモニタリング：重要な品質属性（CQA）を管理し、最適な処理を保証するために、IVT反応中は重要プロセスパラメータ（CPP）をモニタリングする必要があります。効果的なモニタリングにより、製造プロセスの制御が強化され、プロセスの変動に対する迅速な対応が可能になります。
キャッピング：転写後、mRNA転写産物に5’キャップ構造を付加することで、宿主細胞内での安定性とトランスダクションを向上させます。キャップの付加には以下の2つの方法があります：
- 転写同時キャッピング：IVT工程中に実施されます。ただし、効率と収率は低く、結合の誤りや逆取り込みにより、キャップ未付加の不純物が生成される可能性があります。
- 酵素的キャッピング（または翻訳後キャッピング）：mRNA精製後に実施されます。この手法では通常、キャッピング酵素を用いて精製されたmRNAにキャップを付加します。この手法は効率が高い反面、コストが高く、精製後の追加工程となります。
mRNAの精製
インビトロ転写の後、mRNAは、エンドトキシン、免疫原性二本鎖RNA（dsRNA）、残留DNAテンプレート、RNAポリメラーゼ、および元素不純物を含む、前工程で使用された不純物や物質から精製される。mRNAの精製および残留DNAの除去には、いくつかの方法がある。
逆相イオンペア（IPRP）、陰イオン交換（AEX）、およびポリ(dT)キャプチャーを用いたアフィニティークロマトグラフィー（AC）（図3）などのクロマトグラフィー分離法は、標的mRNAを効率的に精製し、DNAテンプレートを除去するため、DNA消化の必要性を排除します¹、³。また、酵素的キャッピングの後にもクロマトグラフィーが用いられ、不要なmRNA転写産物やオリゴヌクレオチド不純物を除去します。
図3：mRNA精製における逆相イオンペアクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーの比較（DBC：動的結合容量）。4,5
- 逆相イオンペアリング（IPRP）は、小規模なスケールで対象となる一本鎖RNA（ssRNA）を効率的に捕捉し、不純物から分離するために利用できます。しかし、この手法は溶媒を必要とするため、GMP製造にはあまり適しておらず、捕捉よりも精製工程に適しています。
- 陰イオン交換（AEX）クロマトグラフィーは高い動的結合容量を有し、dsRNA、キャップのないRNA、RNA-DNAハイブリッド、およびヘアピンmRNAなどの他のRNA構造といった不純物を効率的に除去する。AEXは水溶液を使用するが、樹脂に結合した大きなmRNA分子を脱着させるために、潜在的に毒性のあるカオトロピック剤と最大85 °Cの操作温度を必要とする。
- アフィニティクロマトグラフィー（AC）によるポリ(dT)捕捉法は、樹脂を用いて全長mRNA転写産物のポリ(A)テールを特異的に捕捉する。この方法は、DNA、ヌクレオチド、酵素、緩衝液成分、およびポリ(A)テールを有さないその他の不純物を効率的に除去する。このため、ACは初期のmRNA捕捉に一般的に用いられ、その後、精製のためにAEXが行われる。
- クロマトグラフィー工程の後、最終濃縮およびダイアフィルトレーションを行い、製品の純度を最大化し、製剤化または保存に適したバッファーへmRNAを移します。
スケールアップに関する考慮事項
シングルユース技術は、多数のターゲットをパイプラインに抱える製造業者に対し、スケーラビリティ、適応性、品質を提供し、多くのmRNA GMP製造プロセスの重要な基盤となっています。GMP製造では、TFF（透過膜ろ過）やクロマトグラフィー工程の利点を活用して効率的な大規模分離を行い、小規模なプロセス開発で一般的に用いられる代替的な精製法に取って代わります。留意すべき点としては、以下が挙げられます：
- TFFまたはクロマトグラフィー工程は、mRNAプロセス開発で頻繁に使用される溶媒抽出や沈殿工程に取って代わります。
- mRNAの安定性を高め、mRNAの分解の可能性を最小限に抑えるため、可能な限り高品質な化学薬品およびエンドヌクレアーゼフリー試薬を使用する必要があります。
近年、多数の患者を対象としたmRNAワクチンの導入において大きな成果が得られています。課題は残されているものの、高品質な化学薬品やエンドヌクレアーゼフリー試薬を使用することでmRNAの安定性を最大化し、分離効率を最大化しスケールアップを効率化するためにクロマトグラフィー精製技術を最適化・適応させることに注力した結果、GMP製造テンプレートにおいて大きな進展が見られました。
mRNA技術の潜在能力を最大限に引き出すためには、生産規模で堅牢なプラットフォームを構築するために、革新的なソリューション、専門知識、そして独創性が求められます。当社は、製品、サービス、そして技術的専門知識を駆使し、お客様のmRNA製造プロセスを効率化する統合ソリューションの開発に尽力してまいります。